1 培地を吸引除去。出来るだけ完全に除去。
2. 細胞単層をPBS（>２ml）で２回洗う。液量少ないとFCSが残存してサンプルに混じるので注意。
3. SDS sample buffer (w/o 還元剤, BPB) 目安：0.5ml / 3cm dish 添加してDish前面に手早く行き渡らせる。 液量多すぎると蛋白質濃度低すぎで使えなくなるので注意。ここで失敗する人多い（手間のかかる実験や重要な実験ならばあらかじめ予備実験して適切な液量を把握しておく方が良い）。SDSが入ってるのでプロテアーゼやホスファターゼの心配はあまりしなくてようと思うけど、たくさんの中には活性が残存するのもあるらしので気になるならばインヒビたーを入れておく。
4.スクレイバーでライゼートを静かにDishの端の方に集める。
5. ライゼートを1.5ml チューブに移す。ピペットでとるとき粘性あるのでゆっくり吸う。
6. チップ式超音波装置で低い出力（仮に10段階としたら２くらい）で数秒づつ3~4回処理。粘性がなくなればOK. そんな機器ないという人は、一番細いゲージのシリンジでゆっくり数回出し入れする。泡立ったら卓上遠心を30秒くらいすれば泡消えるか減る。
7. 一部を分取して水で1/10希釈してBCA法で蛋白質濃度定量。 SDS含有サンプルゆえブラッドフォールド法は使えないので注意。
(当日に泳動しないならば、この段階で−８０℃保存可能。)
8. 還元剤とBPB入れて加熱処理。
9.電気泳動へ
*SDS bufferは細胞内蛋白質のほとんどを可溶化するので、もともと存在量の非常に少ない蛋白質の場合、サンプル中の他の蛋白質との相対的な量比の関係で検出が困難になることがたまにある。そのような場合は異なるlysis buffer（界面活性剤なし→TritonX100 buffer →SDS buffer)で細胞を段階的に可溶化するなどして分画して調べるなどの工夫してみると良い。 |
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