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(無題) 削除/引用 No.9746-9 - 2021/06/14 (月) 17:39:59 - G25 おそらく「KO」とだけしか言わないと、KO系統（KOアリルのホモ接合体）のことを指しているのか、KOアリルとかKOという現象や操作のことを言っているのか不明瞭で、文脈からも両義的にとれるところが混乱の元になっていると見ました。 >単純に思い浮かぶのは、shRNAになる配列の挿入といことですが正しいでしょうか？あるいはヘテロKOの細胞も当て嵌まるのでしょうか？ 標的遺伝子が細胞自律的に必須（cell-autonomously essential)なものであれば、nullになれば生存不能である、というごく単純な理屈です。あなたの単純は複雑すぎるようです。 野生型とnullのヘテロ接合の場合は、生きることが多いですが（haplosufficient)、遺伝子量の半減で生存不可となる遺伝子もあります（haploinsufficiet)。

(無題) 削除/引用 No.9746-8 - 2021/06/14 (月) 13:22:33 - Sam みなさま御助言ありがとうございます。 >KOが細胞死に直結する遺伝子であればそもそもKO細胞が得られないですので、その場合はノックダウンを誘導できるような仕組みをノックインしてあげるのが良いでしょう。 単純に思い浮かぶのは、shRNAになる配列の挿入といことですが正しいでしょうか？あるいはヘテロKOの細胞も当て嵌まるのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.9746-7 - 2021/06/14 (月) 09:48:40 - asan 基本的に効率よくKOになるindelが取れるgRNA配列を選ぶことが重要だと思います。

(無題) 削除/引用 No.9746-6 - 2021/06/12 (土) 17:00:42 - AA レンチでも、リポフェクションでも、エレポでもなんでもですが、 基本的にCRISPRを導入する操作をしたそのディッシュでは改変された細胞、CRISPRは入ったけれど改変されていない細胞、そもそも導入自体出されていない細胞、などの不均一な集団になっています。 なのでこのディッシュ、あるいはそこから単純な継代操作をして増やした細胞を用いて解析することは質問者さんの心配されているようなリスクを大きくはらんでいます。 基本的にはやはり一度シングルセルクローニングで株化してから解析に用いるほうが良いと思います。 KOが細胞死に直結する遺伝子であればそもそもKO細胞が得られないですので、その場合はノックダウンを誘導できるような仕組みをノックインしてあげるのが良いでしょう。

(無題) 削除/引用 No.9746-5 - 2021/06/12 (土) 15:14:27 - Sam やはり、そうなのですね。 コメントをいただいて、追加で疑問がわいたので聞かせていただきます。 ホモでKOにするとそのタンパク質が存在しないことになり、仰るとおり、細胞死や増殖抑制につながるかと思います。 実際の表現系を観察するのはどの時期がいいのでしょうか？当然遺伝子により異なると思いますが、細胞死が最終的なイベントになってしまうと何を見ているのかわからなくなります。一方で、早すぎれば、タンパク質が残存しているあるいはそもそもホモKOになっていない可能性もあるかと思います。 この質問おかしいでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.9746-4 - 2021/06/12 (土) 15:04:27 - AA 培養期間を延長することでホモKOの細胞の比率があげられるか、 という趣旨かと思いましたので、短期間と言っても継代まで数日程度を想定していましたが、もちろん短すぎればホモ改変の確率は下がると思います。 ただ、よほど効率の悪いガイドでもない限り、ある程度の期間でプラトーに達するので必要以上に伸ばしても効率は上がりません。 場合によってはKO株のほうがヘテロ株より増殖が悪かったりすれば駆逐される可能性すらあります。 また質問者さんのコメントにある通り、インフレームのNHEJ-indelで両アリルとも標的配列を失ったクローンについては、培養期間を伸ばせばオフターゲットのリスクだけが増加します。

(無題) 削除/引用 No.9746-3 - 2021/06/12 (土) 14:40:01 - Sam それはわかりますが、短時間より、長時間の方が、対立遺伝子の両方に変異が入る可能性が高まります。

(無題) 削除/引用 No.9746-2 - 2021/06/12 (土) 13:34:32 - AA 一度切断されて3の倍数のdeletionがはいると フレームがずれないのでKOにならないが認識配列はなくなるのでもう切れない、 と言う状態になります。 なので培養時間を伸ばせば良いということもありません。

Cas9でホモにKOするには 削除/引用 No.9746-1 - 2021/06/12 (土) 09:20:46 - Sam Cas9でヘテロではなく、ホモにKOするには、培養時間を長くした方がいいのでしょうか？ あるいは培養しすぎるとオフターゲット効果などネガティブエフェクトも出たりするのでしょうか。 レンチでの導入を考えておりますので、Cas9もsgRNAもゲノムに組み込まれることになります。

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