お世話になっております。
培養細胞でsiRNAを用いたknock downの実験を開始しようと検討しております。
イメージとしては設計したsiRNAを48時間程度、細胞に刺激してあげると、mRNAやタンパクの発現の減少が認められるというイメージですが
下記のようなシチュエーションに使用できますでしょうか？
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（既知の事実）因子Aは核内での因子Bの転写を抑制する作用がある。
（既知の事実）因子Bが減るとaktのリン酸化が活性化する。
すなわち、因子Aが減るとaktのリン酸化が不活性化する（既知の事実）
今回、試薬Xによって因子Aが抑制され、因子Bが増えることがわかり(6時間刺激)、同時にaktのリン酸化も不活性化することがわかりました。
ここで因子BをsiRNAによってknock downすることによってaktリン酸化の不活性化が確認されるかどうか（因子A・B以外の経路で作用していることの可能性を否定する）をみたいと思っています。
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ここででてきた疑問点として、
受容体のように内在性に存在する物質のmRNAをknock downした場合ですとリガンド刺激を行っていても下流のシグナルは伝わりにくいということは推測できるのですが
上流因子（この場合は因子A）の転写によって発現が変化するような因子自体をknock downして果たして、発現が減るのかどうかよくわかりません。(試薬X刺激によって通常通り新規に因子Bがどんどん作られてしまう？？)
siRNAの機序をわかっていないために出てくる疑問かもしれません。
ご意見いただけますでしょうか。 |
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