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タンパク質精製でのIPTG誘導後のペレットの保存 トピック削除
No.9735-TOPIC - 2021/06/07 (月) 11:30:37 - 精製初心者
現在Hisタグをつけたタンパク質を精製している者です。
IPTGを加え、一晩大腸菌を振盪培養させたのち、遠心することでタンパク質が大量に発現された大腸菌を含むペレットが得られるのですが、その後の操作で気になることがあります。

得られたペレットを一度−80℃で保存する操作を挟んだ後にbufferに溶かして超音波処理したものとそのままbufferに溶かして超音波処理したものの間でタンパク質の収量に差が生まれたりするものなのでしょうか？
webサイトや自分が扱っている者と同種のタンパク質を精製している論文を探しても明確な答えには行き着きませんでした。

ご存じの方がおられましたらご教授いただければ幸いです。
よろしくお願いいたします。
　
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(無題) 解決済み 削除/引用
No.9735-6 - 2021/06/07 (月) 17:41:36 - 精製初心者
G25先生、ありがとうございます。

封入体の状態だと凍結の影響をあまり受けないということですね。
確かに超音波処理やリゾチーム処理など以外にも凍結融解での溶菌方法もありますね！
言われてみてとても納得しました。勉強になりました。

ご指摘の通り、表現に誤りがあって、溶解（溶かす）ではなく懸濁ですね。大変失礼いたしました。



noname先生、ありがとうございます。

少し菌体を壊しやすくなるのですね。G25先生のご教授と相まって納得しました。
確かに条件をそろえた方が余計な検討をせずに済みそうですね！これからは凍結の条件で進めていこうと思います。ありがとうございます。

すみません、質問文中に誤りがあって、正しくは溶解ではなく懸濁でした。大変失礼いたしました。

(無題) 削除/引用
No.9735-5 - 2021/06/07 (月) 15:46:50 - G25
大腸菌の沈殿でしたか。読み違えてました。
「大腸菌を含むペレット」あたりで混線したようです。

いずれにしても、絶対にとは断言できないですが、どのタイミングで凍結しても、大差ないです。私なら、凍結保存を溶菌後にするメリットがない以上、溶菌せず沈殿を直接、凍結します。

溶菌する手法に沈殿を凍結融解する方法があるくらいだから、沈殿の凍結はいくらかメリットが有る。

溶菌後はタンパク質が分解、酸化や物理的ストレス酸化など無防備になりがちなので、保存するのが当面の目的ならインタクトな状態で凍結したほうがいい。これは、生物試料一般的にもいえますが。

(無題) 削除/引用
No.9735-4 - 2021/06/07 (月) 15:27:52 - noname
精製初心者さんの言っているペレットというのは
集菌した大腸菌菌体全体のことを指していると私は読めました。
上記の解釈があっていると仮定してお話を進めますと、
たいていの物はあまり違いはないです。
ただ、バッチごとに条件が違うと余計な検討をしないといけないので
集菌したら一度凍結させる or すぐに破砕してしまうなど条件をそろえたほうが良いと思います。

余談ですが、一度凍らせると若干ですが菌体を壊しやすくはなります。


G25さんの言っているものは破砕→遠心後の沈殿物のタンパク質が
可溶化していないもので、おっしゃっているように変性状態で溶解させてあげる必要があります。

(無題) 削除/引用
No.9735-3 - 2021/06/07 (月) 12:11:07 - G25
まったく違いがないとは断言できないけれど、どっちでも大差ないと思います。

なぜなら、発現したタンパク質がペレットとして回収されるということは、
封入体　inclusion bodyになっているわけで、封入体はそうそう状態変化しないからです。

バッファーに溶かして超音波処理なんていいますけど、変性条件でもなければ溶けません。せいぜい粉砕された封入体が懸濁するくらいです。つまりやってもやらなくてもモノ自体の状態は変わらない。
どちらかというと懸濁前の沈殿の状態で凍結保存したほうが、余計な操作を挟まないだけいいと思います。

タンパク質精製でのIPTG誘導後のペレットの保存 削除/引用
No.9735-1 - 2021/06/07 (月) 11:30:37 - 精製初心者
現在Hisタグをつけたタンパク質を精製している者です。
IPTGを加え、一晩大腸菌を振盪培養させたのち、遠心することでタンパク質が大量に発現された大腸菌を含むペレットが得られるのですが、その後の操作で気になることがあります。

得られたペレットを一度−80℃で保存する操作を挟んだ後にbufferに溶かして超音波処理したものとそのままbufferに溶かして超音波処理したものの間でタンパク質の収量に差が生まれたりするものなのでしょうか？
webサイトや自分が扱っている者と同種のタンパク質を精製している論文を探しても明確な答えには行き着きませんでした。

ご存じの方がおられましたらご教授いただければ幸いです。
よろしくお願いいたします。
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