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(無題) 削除/引用 No.9730-10 - 2021/06/09 (水) 01:06:55 - おお >[Re:6] あいかさんは書きました : > Winterさん、おおさんありがとうございます。 > 特定の遺伝子領域をビオチン標識プライマーで増幅する予定ですが、ビオチンでも検出可能でしょうか？ ちゃんと結合すれば検出はできると思います。蛍光で検出ということですが、検出感度としてはRI、Luciferase、Chemiluminescence、の次の検出感度が蛍光です。やってみて検出が難しいと感じたならChemiluminescenceにシフトすることを考えてもいいかもしれません。 > > ＞＞気になるところは私はDNAと蛋白を同時に検出している系を見たことがありません。 > > そうなると別のアッセイの方が良いのでしょうか？ターゲットとしているDNA領域を増幅して、そこにたんぱくが結合していることを示したいと考えているのですが、、 別のアッセイの方がいいとは言ってませんが、、、 ゲルシフトでDNA（核酸プローブ）のシフトをみていて、同時に蛋白を検出しようとしているデーターは見たことがないと言っているだけです。ですから蛋白を見たところで予期しないデーターが出てもおかしくないかなと思っているだけです。プローブのシフトが加えられた蛋白によるものであることを示すのに、蛋白ーDNAを混ぜた溶液に抗体を加えてゲルに流すのが一般的です。

(無題) 削除/引用 No.9730-9 - 2021/06/09 (水) 00:35:04 - おお >[Re:7] T-2さんは書きました : > 一般的にゲルシフトはプロモーターやエンハンサー領域の > 特定の転写因子が結合する配列を用いてCell lysateや > リコンビナントを流して結合を見るものと思うのですが。 いや転写因子に限らずDNAに結合する蛋白（場合によってはRNA）全般にこの方法は応用できます。ま、質問者がプロモーターを考えているのかその他のことを考えているのはよくわかりませんけど。また場合によってはエンハンサー（TF結合領域）がプロモーターの下流にあることもあります。

(無題) 削除/引用 No.9730-8 - 2021/06/08 (火) 22:05:19 - Winter-8 >特定の遺伝子領域をビオチン標識プライマーで増幅する予定ですが、ビオチンでも検出可能でしょうか？ 業者のカタログや過去の文献を見ても、DNAに直接蛍光標識することが多いかと思います。 抗体やビオチンを介する必要性を感じませんが、何か理由はあるんですか？ >そうなると別のアッセイの方が良いのでしょうか？ターゲットとしているDNA領域を増幅して、そこにたんぱくが結合していることを示したいと考えているのですが、、 私も、おおさんと同様、DNAとタンパク質を同時に検出する実験例を知りません。基本的にはDNAの移動度だけで結合を判断するものだと思います。（それ故に、非特異的な相互作用の可能性を排除できる実験系が重要だと思います） ただ、分野が異なると全く違った手技・手法があったりするので、なんとも言えません。 ご参考までに！ということで。

(無題) 削除/引用 No.9730-7 - 2021/06/08 (火) 18:48:05 - T-2 質問者さんの質問を見てちょっと思ったのですが、 一体何を見たいのかわかりません。 大昔にアイソトープ使ってゲルシフトをやってただけなので 最近のことはわかりませんが、質問者さんの内容だとcDNAと書いてあったので A遺伝子のORF領域に結合するタンパク質を同定したいのですか？ 一般的にゲルシフトはプロモーターやエンハンサー領域の 特定の転写因子が結合する配列を用いてCell lysateや リコンビナントを流して結合を見るものと思うのですが。

(無題) 削除/引用 No.9730-6 - 2021/06/08 (火) 16:30:59 - あいか Winterさん、おおさんありがとうございます。 特定の遺伝子領域をビオチン標識プライマーで増幅する予定ですが、ビオチンでも検出可能でしょうか？ ＞＞気になるところは私はDNAと蛋白を同時に検出している系を見たことがありません。蛋白とDNAの結合の親和性を考えると安定したコンプレックスがゲル内で移動しているのは不思議だという解説を見たことがあります。 そうなると別のアッセイの方が良いのでしょうか？ターゲットとしているDNA領域を増幅して、そこにたんぱくが結合していることを示したいと考えているのですが、、

(無題) 削除/引用 No.9730-5 - 2021/06/08 (火) 01:05:43 - おお まあ誰でも最初は初心者ですし、、、 対象の蛋白（材料）やプローブによって難易度は変わってくるかもしれませんが、まあゲル内でコンプレックスが保たれていたらいいわけですし、安定な結合が形成されれば容易なたぐいです。 Cell lysateなどだと、考えている蛋白以外のものが結合することもあるし、検出感度も重要になってきますから条件の検討で多岐にわたることをしないといけないかもしれません。しかし質問からするとリコンビナントか精製した蛋白を使うということなのでそこまで難しくないのではと思います。 あと、検出感度は万全にしておいたほうがいいです。そのへんはラベルをするならその時の効率などちゃんと確認しながら進めたほうがいいです。 気になるところは私はDNAと蛋白を同時に検出している系を見たことがありません。蛋白とDNAの結合の親和性を考えると安定したコンプレックスがゲル内で移動しているのは不思議だという解説を見たことがあります。最初はDNA蛋白のコンプレックスで移動するけど途中で乖離するなら、蛋白とDNAは同じ場所にないと言うことになります（これについては真偽はわかりません）。

(無題) 削除/引用 No.9730-4 - 2021/06/07 (月) 21:37:28 - Winter-8 それほど経験があるわけではないですが、私は20~100bpぐらいの断片を使っています。 非特異的な吸着が出てくるので、短い方が結果がわかりやすいような気がします。 短いとそのぶんバンドが薄くなるので、予算に余裕があるなら、 蛍光ラベルを付加したものをお勧めします。 混ぜてゲルに流すだけなので、（お金とタンパクがあるなら）とりあえずやってみたら〜と思います。 ご参考までに。

(無題) 削除/引用 No.9730-3 - 2021/06/07 (月) 14:17:47 - あいか おおさんありがとうございます。 ゲルシフトはしたことないのですが、本とかに書いてあるプロトコール通りしてできるようなものではないのでしょうか？ ネットで調べると色々条件が合って初心者では難しいと記載してありました、、。

(無題) 削除/引用 No.9730-2 - 2021/06/06 (日) 17:48:38 - おお 実験の目的によっていろいろと方法も手を加えるだろうし、あなたの実験で何がベストなのかわかりませんが、プローブとして使うDNAはゲル内で移動度が短いと（DNAが長いと）蛋白の結合でのシフトが見づらくなります。数百ベースでも移動度が短く結合の判断が難しくなる可能性が高いです。 あと当然ですが長いとその断片のどこに結合したのかという意味で直接的な実験結果ではなくなり、変異を使うと解消できるかもしれませんが、複数の結合場所があれば変異も有効ではなくなるでしょう。 また典型的な昔からあるゲルシフトはDNAだけラベル（RIラベルがたいてい）して蛋白の検出はしません。ただしすることで有用だと感じるならしたらいいでしょう。よくやられる方法は蛋白の抗体を加えてスーパーシフトしたりすることで蛋白の結合を証明する方法ですが、蛋白と同じ位置にシフトするのがしめせるなら蛋白の検出も有効かもしれません。

ゲルシフトアッセイについて 削除/引用 No.9730-1 - 2021/06/06 (日) 15:31:49 - あいか いつも勉強させて頂いています。 ゲルシフトアッセイについて質問です。 A遺伝子を増幅させた後、ゲルシフトアッセイを行います。 A遺伝子の増幅は、A遺伝子をもつプラスミドを使ってPCR増幅する予定です。 一部の領域との結合を見るだけなのですが、この場合その領域だけ（例えばエクソンだけ）増幅した方がよいのでしょうか？ それともcDNA全長を増幅した方がよいのでしょうか？ ゲルシフトアッセイを行うとき長いDNA断片は何か支障ありますでしょうか？ またゲルシフトアッセイでは、タンパクにはビオチン標識、DNA（プライマー）にはDIG標識する予定です。後でアクリルアミドゲルで泳動しますが、それぞれ異なる蛍光色素標識した抗ビオチン抗体と抗DIG抗体で確認しようかと考えています。 実験デザイン的にいかがでしょうか？

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