＞MCSにタンパクBを挿入する場合、開始コドンがインフレームであればそれ以外特に挿入する位置はMCS内であれば気にしなくてよいでしょうか？
コザックについてはあとに書いてますが、蛋白Bと下流のフレームが一致すると言うことを言いたいのですよね。最低限それは必要です蛋白Bと下流の蛋白の間にいくらか塩基が入っているならフレーム以外にもそのフレームで読んでストップコドンが生じてないか確認してください。当たり前ですが蛋白Bのストップコドンは含めないように。
>CMVプロモーターの開始点について正確な情報がなく、、。
正確な情報がないなら私も答えられません。一般論として転写開始点より下流にMCSをおいているとは言えます（あなたの使おうとしているものは知らない）。CMVプロモーターの転写開始点を一般的な情報から入手するとあなたのベクターにおいてどこから転写が起こるか予測できると思います。基本わからなかったら調べろです。いろいろと問題点を考えているところは、なんのうたがいもなくMCSに入れようとする人よりあるいみ優れていると思います。
fusionタンパクといってますが、例えば「この蛋白を発現するベクターを作ってくれ」といわれて配列を渡されたら、その配列がfusionタンパクであろうが、何であろうがやることは一緒です。開始コドン周辺にコザックをつけてその配列を挿入するということ。
>AタンパクAの前のコザックはこの場合残していても問題ないのでしょうか？
なるべくなら潰したい。なぜならせっかくFusionとしてデザインしても、そこから翻訳が開始されたら元の木阿弥。潰さなくてもうまく行っている例は多分あると思うけど。
>Bタンパクを挿入するときですが、よくORFの配列が挿入されていると思います。5'や3'非翻訳領域は特に考えなくてよいでしょうか？
これは今回の話ではないですよね。今回はタンパクBのFirst Mにコザックをいれて、ストップコドンを削ってIn frameで下流の遺伝子をつなげるので蛋白BのUTRは入れる余地がないはず。
一般論としてUTRはなるべく含めないです。スクリーニングの過程で全長がとれてそのまま発現させているとか言うのはあるかと思います。いちどUTRの役割を考えてみてください。 |
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