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(無題) 削除/引用 No.9716-8 - 2021/06/04 (金) 13:25:06 - AA CRISPRコンポーネントの導入はウイルス等によるものなのでこれも非HDRかと思います。 私も自分で実施しているわけではないのですが、たしかウイルスであれば力価を調整して1細胞に1コピーはいるようにするのだったと思います。 感覚的にですが、HDRのようなtargeting insertionではsgやCas9の導入効率が低すぎて実験が成り立たなそうです。

(無題) 削除/引用 No.9716-7 - 2021/06/04 (金) 11:53:00 - けも 私自身はCas9スクリーニングをしたことながいので、論文から得た知識ですが。。。 Cas9とsgRNAをともに含むプラスミドをレンチを使って、導入すると90％以上の細胞でこのプラスミドが、ゲノムにインテグレーションします。Cas9とsgRNAは発現するので、時間が経てば、遺伝子がNHEJなりHDRで損傷を受けます。すると表現型が現れるので、表現型が現れた細胞を回収してゲノム解析すると、どのsgRNAが導入されているのか検出できる というのが原理だと考えています。合っていますか？

(無題) 削除/引用 No.9716-6 - 2021/06/03 (木) 14:51:25 - mr 言い方が悪かったです。フレームシフトという言い方よりも、HDRによるspacerのインサーションといったほうがよさそうですね。 Cas9スクリーニングの場合、sgRNA中のspacerのインサーションを次世代シークエンサーで検出する形になると思います。 従って、NHEJによる数塩基の変異を読むのではなくて、spacerの有無がデータの解釈に重要と考えていますが、そうなるとNHEJとHDRの割合が極めて重要な気がします。 上記の解釈あっていますか？

(無題) 削除/引用 No.9716-5 - 2021/06/03 (木) 14:41:41 - AA ちょうど先週Nat.CommにCas9 screeningの論文が出ていましたね。 (Nature Communications volume 12, Article number: 3055 (2021)) 導入の方法にもよるんでしょうが、ある程度継続的にCas9とsgRNAが発現すれば、 大抵の場合はホモの改変になると思います。 各アリルの改変型式はもちろん一致しないことも多いと思いますが、フレームがずれさえすれば良いならあまり問題はないでしょう。 >>deletionやinsertionを起こすいわゆるNHEJのケースと、FrameshiftをおこすHDR NHEJとHDRは修復型式の名前であって、フレームシフトが起きる起きないとは関係ありません。 当然、NHEJによって3n+1,3n+2のindelが起きればフレームシフトしますし、 対立アリルがリファレンスになるならHDRではフレームシフトは起こりにくいでしょう。

(無題) 削除/引用 No.9716-4 - 2021/06/03 (木) 12:30:24 - mr Cas9スクリーニングを私も行おうとしています。 Cas9を作用させると、deletionやinsertionを起こすいわゆるNHEJのケースと、FrameshiftをおこすHDRの2種類が起こりえると思います。 Cas9スクリーニングではHDRしか検出できないと解釈していいのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.9716-3 - 2021/05/31 (月) 15:24:23 - おお near-haploid human cell line HAP1というのがあるし、Cas9 Crispr screeningでもよく使われているのではないかな。またHaploinsufficiencyという言葉もあるので必ずしも２本染色体があって１本だけKOされても変化が見られるものもある。効率のいいKOが得られる実験系だと完全なKOも期待できるだろうし。活性などが数値化されるのなら、有意に変化あるものを探せるので必ずしも半分とか２倍とか言う話でなくてもいい。生存や増殖に有利になるKOだとそういうバイアスがかかるので多少効率が悪くてもスクリーニングしやすい。 要するに実験のデザインでCas9 Crispr screeningがいいかどうかを判断するべきだと思う。

(無題) 削除/引用 No.9716-2 - 2021/05/31 (月) 13:00:30 - が diploidの細胞でも、その多くがホモの欠失になります。 CRISPRによるKO効率によります。

Cas9 Crispr screeningの有効性 削除/引用 No.9716-1 - 2021/05/31 (月) 12:23:10 - ポポ 最近、Cas9 Crispr screeningを用いた論文が無数にpublishされています。基本的にはヘテロの欠失と考えますが、これで結果が出るのが不思議です。 半分のタンパク質(実際にはフィードバックで7割？)になれば、十分な表現型が出るのでしょうか？

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