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(無題) 削除/引用 No.9711-5 - 2021/06/02 (水) 05:16:57 - おお IRESやP2Aなどをつかうと２つの蛋白のCDSを融合せずにおなじmRNAに乗せることができます。Transfectionする実験ならこれでGFPによって発現レベルを推測することができます。もちろんそれぞれの蛋白の安定性の違いの差が出るかもしれません。ちなみにGFPは細胞内でかなり安定です。 細胞が死んでいてもいいなら、固定、透過処理をして抗体で染めればフローサイトでも検出できるとおもいます（実際にやられてます）。ただし厳密とおっしゃるけど、不溶性の集塊を作るなら抗体がアクセスできない分子もあるだろうから抗体で検出しても厳密とは限らないですよ。

(無題) 削除/引用 No.9711-4 - 2021/06/01 (火) 14:17:17 - ポポ 返信、ありがとうございます。 GFPを融合すると、蓄積物の形状や絶対量を変えるあるいは、細胞内蓄積物の性質が変化する可能性もあると考えているからです。 結晶を形成するわけではありませんが、不溶性の集塊になって、蓄積し続けるものです。 もちろんこういうことを無視して、GFPの光量で分類したらいいのかもしれませんが、、、あまり厳密に実験系にこだわりすぎるのも良くないかもしれないですね。

(無題) 削除/引用 No.9711-3 - 2021/05/31 (月) 21:48:49 - ema 実験目的、手法等の情報が少なく、答えにくいです。 「仕分け」という言葉からソートするように思いましたが、アナライズで良いのでしょうか。ソートして培養なり他の実験に使うなり、したいのでしょうか。 細胞表面を抗体染色するなら生きていますが、細胞室内に抗体を入れるためには固定して細胞膜にサポニンなどで穴をあけて抗体を中にいれないと染色できないと思います。だからこそ「おお」さまが生きていてい欲しいなら融合タイプの実験設定をお勧めしているのだと思います。 また、大量に細胞があるからFCMなのでしょうか。少量で分取ならセルピック手法でもできます。 well内の染まった細胞の多い少ない判定だけなら、顕微鏡やプレートリーダーのようなものでも計算可能です。

(無題) 削除/引用 No.9711-2 - 2021/05/28 (金) 17:10:06 - おお Transfectionする実験？細胞は死んでいてもいいの？融合できない理由は何？

細胞質内に蓄積したタンパク質量に応じてFACSで仕分けする 削除/引用 No.9711-1 - 2021/05/28 (金) 16:44:37 - Ken 細胞質内に蓄積したタンパク質量に応じてFACSで仕分けすることは可能でしょうか。 ちなみにGFPは融合できないので、抗体等で検出することになるかと思います。

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