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(無題) 削除/引用 No.9710-8 - 2021/05/28 (金) 19:27:28 - jl CO2インキュベータを使わないでかつHEPES系ならば培地にNaHCO3入れないで培養してみてください。CO2インキュベータ外での培養ということですので、外気との間の炭酸緩衝系でありませんからCO2は抜ける一方ですので最初に合わせたpHからは値が上がってくるため、赤くなってくるのだと思います。

(無題) 削除/引用 No.9710-7 - 2021/05/28 (金) 17:29:36 - 774 ＞記載し忘れていたのですが、24 well plateを使用する際には、密閉容器(タッパー)を用いています。 また、24 well plateは密閉できないからと思い、パラフィルムで密閉して培養したこともあります。 どちらの場合でも、この現象が起きるのですが、密閉不足なのでしょうか？ このくらいだと完全な密閉とは言えないと思います。 経験では50mLファルコンチューブでも培地を分注してフタをしっかり閉めても数日で培地のPHが上がってくるので。。。 あとCO2インキュベーターは小型で乾熱滅菌機能がないものなら30万円程度で買えるものもあるのでぜひ検討してみてください。

(無題) 削除/引用 No.9710-6 - 2021/05/28 (金) 15:25:25 - qqq > 細胞を播種する際に、播種し始めはオレンジ色なのですが、24 well plate全部に播種し終わった時点でもう赤(ピンク)に近い感じです。 > 継代後する際には、翌日にはオレンジに近い色に戻っているのですが、24 well plateに播種すると翌日にも色が赤っぽい感じです。 代謝によって酸性に傾いた状態をベースに考えていますね。 オレンジに戻ったんじゃなくて、通常大気平衡下(普通の培養条件よりCO2濃度が極めて低い)ではアルカリに傾いて赤紫の培地が代謝によってオレンジになるんです。 通常条件でまいたとき朱色だったのが培地交換せず増やし過ぎたら黄色になるのと同様です。 コーティングの変質でなく至極当然のことです。 > 今後もこのようなトラブルが起こると考えると、CO2インキュベーターを使用した方がいいと思いました。 > CO2インキュベーターの導入を検討いたします。 それができるならそうした方が良い。 あまり使われていない手法を使うならそれを選ぶ理由や妥当性の説明が必要ですから。

(無題) 削除/引用 No.9710-5 - 2021/05/28 (金) 14:37:50 - わ qqqさん 細胞を播種する際に、播種し始めはオレンジ色なのですが、24 well plate全部に播種し終わった時点でもう赤(ピンク)に近い感じです。 継代後する際には、翌日にはオレンジに近い色に戻っているのですが、24 well plateに播種すると翌日にも色が赤っぽい感じです。 コーティングの変質については考えていませんでした。 調べてみます。 ごんたさん 記載し忘れていたのですが、24 well plateを使用する際には、密閉容器(タッパー)を用いています。 また、24 well plateは密閉できないからと思い、パラフィルムで密閉して培養したこともあります。 どちらの場合でも、この現象が起きるのですが、密閉不足なのでしょうか？ おおさん 回答ありがとうございます。 今後もこのようなトラブルが起こると考えると、CO2インキュベーターを使用した方がいいと思いました。 CO2インキュベーターの導入を検討いたします。

(無題) 削除/引用 No.9710-4 - 2021/05/28 (金) 14:19:44 - おお NaHCO3は外気のCO2濃度とのバランスでpHの緩衝効果を得るために入れるものです。容器が密閉されていたらある程度NaHCO3からCO2が放出されてアルカリに偏るが、密閉容器内のCO2濃度も上がるのであまりpHに変化がないように見えるけど、密閉されていなかったらどんどんアルカリに偏っていく。ボトルに入った培地ですら封を開けてすぐのときと使い切る前ではフェノールレッドの色も違って徐々に赤くなっているぐらいなので、フラスコなど密閉して培養していてもすぐにトラブルになると思う。 ほんとにCO2（インキュベーター）なしで培養したいなら、ライボビッツL-15培地とかCO2に依存しない培地を使うのも手だけど、必ずしも生理的状態がCO2インキュベーターを使った培養時と一緒ではないので予期できないこともあると思う。 http://www.lonzabio.jp/catalog/386/ ちなみにライボビッツL-15培地をつかってCO2インキュベーターで培養した人がいて、翌日には培地がマッキッキで目も当てられなかった。

(無題) 削除/引用 No.9710-3 - 2021/05/28 (金) 13:37:53 - ごんた プレートは密閉できませんからね。はい。

(無題) 削除/引用 No.9710-2 - 2021/05/28 (金) 13:36:25 - qqq >継代後やplateに播種前の培地の色はオレンジに近かったのですが、播種直後にはピンク〜赤色に変化してしまいます。 > フェノールレッドの色が、赤に近くなるということは、pHが高くなっているということだと思うのですが、何が原因なのかわかりません。 プレートにまく前はオレンジで、まくと瞬時に赤になると? 剥がして遠心して再懸濁して希釈して、とやっている間に徐々に(これなら普通です、でもそもそも通常大気組成で培養しているなら恒温器の中でも外でも平衡はほぼ変わらないはず)ではなくまいた瞬時に? それが本当ならプレートのコーティングが変質しているとか。

CO2インキュベーターなしの293細胞の培養について 削除/引用 No.9710-1 - 2021/05/28 (金) 13:06:34 - わ CO2インキュベーターが研究室にないのですが、293細胞(付着性)を用いた実験を行っています。 ネットで調べたところ、「Hanks塩で調整されたMEMで培地を調整した場合、フラスコのキャップを密閉すればCO2インキュベーターがなくても培養することができる」と記載されていました。 実際にHanks塩のMEMに0.35 g/LのNaHCO3、10%FBSと1%のペニシリン/ストレプトマイシンを添加し、調整した培地で培養したところ、培養はでき、継代もできました。 しかし、実験に用いるために24-well plateに播種(1×10^5 cells/well)したところ、翌日に観察しても細胞があまり付着していませんでした。 細胞を播種する際に気づいたこととして、培地の色の変化がありました。 フェノールレッド含有の培地を使用しており、継代後やplateに播種前の培地の色はオレンジに近かったのですが、播種直後にはピンク〜赤色に変化してしまいます。 フェノールレッドの色が、赤に近くなるということは、pHが高くなっているということだと思うのですが、何が原因なのかわかりません。 同じような経験をされたことがある方、いらっしゃいませんか？ また、その際の対処法などが分かる方がいらっしゃれば、ぜひ教えていただきたいです。 宜しくお願い致します。

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