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ウェスタンブロットでの血漿サンプルIgG トピック削除
No.9707-TOPIC - 2021/05/27 (木) 14:07:00 - ウェストさん
ヒト血漿サンプルでウェスタンブロットを行いたいのですが、血漿中のIgGが2次抗体のHRP標識抗動物IgGと交差反応しそうだなーと思っております。

IgG除去キットも調べたのですが10サンプルで4万円などルーチンで使うには高額過ぎました。

論文では当たり前のように血漿サンプルでウェスタンブロットをしているのですが、この辺問題にならないのでしょうか。
 
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No.9707-5 - 2021/06/02 (水) 17:41:59 - G25
さきのレスにもちょっと出ていたけれど、
非変性IgG特異的抗体を使うのがシンプルじゃないかな。
https://www.cosmobio.co.jp/product/detail/rkl-20121225.asp?entry_id=10334

異種IgGであることもあるし、二重の対策になるでしょう。

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No.9707-4 - 2021/06/02 (水) 15:58:08 - tts
精製タンパクや培養細胞などのポジコンも一緒に流せば、血漿由来IgGの影響を確認できるので、一旦やってみてはいかがでしょう

(無題) 削除/引用
No.9707-3 - 2021/05/27 (木) 19:40:24 - fghjk
2次抗体が認識する1次抗体の動物種や吸収処理の有無など使用する2次抗体次第なのでなんとも言えません。吸収処理済みの製品でも血清のようにIgGが非常にたくさんあればそれなりに反応します。1次抗体を直接酵素標識して2次抗体なしで検出すればやや感度は下がるものの一番確実と思います。抗体液の内容(含有する成分)によっては難しい場合もありますが。簡単な方法で抗体を標識するkitはいくつかのメーカーから市販されています。

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No.9707-2 - 2021/05/27 (木) 16:50:29 - おお
絶対にならないとは言い切れませんが、人をはじめ他の動物のIgGで吸収除去されたもの、変性IgGには反応しにくいもの、特異的エピトープからのモノクローナル抗体を利用したものなどあります。
かなりひとIgGのシグナルが抑えれるでしょうけど、あなたの目的の蛋白からのシグナルが弱いと目立ってくるかもしれません。

それでもじゃまになるなら非還元条件で流すとほとんどのIgGは百数十kDaぐらいに来ますので100以下ならじゃまにならないかもしれません。

ウェスタンブロットでの血漿サンプルIgG 削除/引用
No.9707-1 - 2021/05/27 (木) 14:07:00 - ウェストさん
ヒト血漿サンプルでウェスタンブロットを行いたいのですが、血漿中のIgGが2次抗体のHRP標識抗動物IgGと交差反応しそうだなーと思っております。

IgG除去キットも調べたのですが10サンプルで4万円などルーチンで使うには高額過ぎました。

論文では当たり前のように血漿サンプルでウェスタンブロットをしているのですが、この辺問題にならないのでしょうか。

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