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(無題) 削除/引用 No.9703-6 - 2021/05/29 (土) 04:31:05 - おお からのベクターに入れ直すという発想もあります。 発現ユニット全域のシーケンスがベストだと思いますが、トランスフェクションして発現がすぐに確認できるのなら目的の遺伝子の配列の確認で済ますてもあるにはある。

(無題) 削除/引用 No.9703-5 - 2021/05/26 (水) 15:56:43 - 分子生物学初心者です ＞G25さま そのとおりですね！ そう言っていただくと納得しました！ 知識がなく、不安に思っていたのでありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.9703-4 - 2021/05/26 (水) 15:51:01 - 分子生物学初心者です ＞無名さま ありがとうございます。 ポリメラーゼは、KODplus ver.2を使っています。 今回は30サイクルでかけてしまっていたのですが、インバースの時は20サイクルぐらいでいいんじゃないかと聞きました。 そうですね、組み込んだところだけでいいですかと相談してみようと思います。 ご助言ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.9703-3 - 2021/05/26 (水) 15:45:33 - G25 CMVということはトランスフェクション等で真核細胞に遺伝子発現させるんだと思いますが、 プラスミドベクターの中でそれに必要とされるモジュールの含まれる範囲のシークエンスを確認すればいい、というか確認したほうがいいんじゃないですか？　遺伝子のインサートだけでなく例えばプロモータ付近までとか。 それ以外にプラスミド骨格に必要な要件はなんですか？ 選択薬剤に耐性で大腸菌で増やせればいいんですよね。 たとえ変異が入っていても、そういう機能がインタクトなら構わないでしょ。 で、そういう機能に支障をきたすような変異が入っているクローンだったら、そもそもコロニーが生えてこないし、プラスミド精製をしたりすることもできないはず。 ちゃんとプラスミドとして機能している以上、プラスミド骨格のシークエンス確認は無意味といっていいでしょう。

(無題) 削除/引用 No.9703-2 - 2021/05/26 (水) 14:16:08 - 無名 プラスミド一周する時間と予算が取れるなら好きなだけすればよいと思いますが、KODとかPrime Starクラスのポリメラーゼを使っているなら、普通は組み込んだ部分のみでしょう。 指導教官と相談といったところでしょうか。

シーケンスの範囲について 削除/引用 No.9703-1 - 2021/05/26 (水) 13:14:01 - 分子生物学初心者です 実験をはじめたばかりの学部生です。 目的の遺伝子を組み込んでいるCMVのプラスミドから、In-fusionを使って、目的遺伝子の一部を欠損させることになりました。 In-fusionだと、InversPCRで遺伝子の一部を欠損させることができて、今、ミニプレをした後、制限酵素処理により、ベクターから目的の遺伝子の一部が欠損したことをバンドで確認しています。 稚拙な質問で、すみません。 この場合、シーケンスってどの部分をかければいいのか迷っています。 今までは、PCRによって組み込んだ目的の遺伝子部位のみサブクローニングした時シーケンスしてました。 しかし、今回の場合はInversPCRなので、プラスミド一周した方がいいのか、目的の遺伝子のみの部分でいいのか悩んでいます。 アドバイスいただけると嬉しいです。

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