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(無題) 削除/引用 No.9689-11 - 2021/05/21 (金) 01:31:15 - クェrちゅいおp＠ぎゅ 1. トランスフェクション 試薬と細胞にはマッチングというか合う合わないがある。うまくいかない時は使っている細胞にあう試薬の変更も検討したほうがいい。実際これで解決することある。 2.もし今のものでうまくいかないなら siRNAは多少値段が高くなってもvalidatedのものを使うのが良いと思う。 3. あくまでもタンパク質レベルで十分な発現抑制がかかる条件を設定すべきと思う。mRNAの発現動態とタンパク質のそれとは必ずしも同じではない（タンパク質の量的変化は時間的にしばしばだいぶ後ろにずれる）ので、仮にmRNAレベルで抑制がかかる条件を設定できたとしても、タンパク質はタンパク質で改めて検討が必要になる。ならば初めからタンパク質レベルで発現抑制される条件を探ったほうが効率的と思う。 4. こういった実験の予備検討に際して48時間での１点で見ているのってそれどうよと思った。RNAiでの発現抑制ではmRNAにしろタンパク質にしろ経時的に抑制効果やmRNAやprotein量は変わっていくし（だんだん下がってまただんだん上がる）、その変化の仕方もまた遺伝子ごとに様々なので、少なくとも３〜５タイムポイントで見ないといい感じの大事なところ（タンパク質レベルで最も発現が低くなるタイムポイント）を見逃して、外れたところで評価してしまう危険性がある(ていうかそれがあるのでまずは普通に複数ポイントでみてsiRNA入れてからだいたい何時間後くらいがいい感じというデータを得る)。 5. 経験的には、がん細胞株だから入りにくいということは感じない。実際、HeLa cellでsiRNA実験はみなさんよに日常的によくやってるし、この前もやったけど普通にできた。マクロファージだとか初代培養細胞とかは結構難しいという話は以前聞いたことあるけど、今はそれ用のとランスフェクション 試薬があるらしいのであまり聞かなくなった。

(無題) 削除/引用 No.9689-10 - 2021/05/20 (木) 10:54:57 - 右 皆様ありがとうございます。最終的にはタンパクレベルでノックダウンをするつもりですが、まずはmRNAを確実に落とせる条件を探そうとしています。 使用している細胞は癌細胞株なので、入りづらいかもとは言われました。しかし、この細胞で同じようにstealthRNAとRNAiMAXを使用してノックダウンをしたという論文があるため、可能であるはずだと思っています。 条件検討では24wellに1×10^5/wellで細胞をまき、5pmolのsiRNAを1.5uLのリポフェクタミンで入れようとしていました。 リポフェクタミンの量はどの程度まで上げれるのでしょうか？ GFPの導入、リバーストランスフェクション、試してみたいと思います。あとはトランスフェクション試薬を変えてみるなどを考えています。

(無題) 削除/引用 No.9689-9 - 2021/05/20 (木) 00:50:35 - おお HeLaとかHEK293などトランスフェクションしやすい細胞なら、GFP発現ベクターとsiRNAを混ぜてDNA導入用のリポフェくたミンで導入してみたらどうか。siRNAもRNAi用の試薬が出る前まではDNA導入試薬でトランスフェションしていたしちゃんと入る。リン酸カルシウムでも入るが使う量が半端ない（キャリアーDNAなど使えば減らせるかもしれないが）。

(無題) 削除/引用 No.9689-8 - 2021/05/19 (水) 09:07:40 - み >[Re:7] iiさんは書きました : > RNAiMAXはインキュベーション5分ですね。 5 min本当ですね。失礼しました。 stealth RNAiを今まで２０本くらい購入していますがはずれた経験ないくらいBlockiTでしたっけ？今もこの推奨ソフトを使っているのか知りませんが成績が良い。 GFPや蛍光物質取り込ませるなりして使用している細胞への導入率を調べた方が良い。

(無題) 削除/引用 No.9689-7 - 2021/05/19 (水) 08:43:22 - ii RNAiMAXはインキュベーション5分ですね。 PCRのプライマー設計は大丈夫でしょうか？ あとターゲットの細胞の種類によってはそもそもKDがかかりにくいのかも。

(無題) 削除/引用 No.9689-6 - 2021/05/19 (水) 02:52:40 - み nMという濃度で記載されているが液量が不明だから実質何モルのsiRNAを使用したのか分からない。 細胞数も70-80%コンフルエントと言われても培養スケールが不明だから分からない。 RNAiMAXの量も多分少ないのかなと想像するがsiRNAの了解が不明だから判断できない。 反応時間5分で細胞に添加ですか？本来のプロトコールは20分くらい反応するんじゃなかったですか？よって、やってる事が無茶苦茶だからノックダウンされなくて当たり前だろうと想像する。

(無題) 削除/引用 No.9689-5 - 2021/05/19 (水) 01:58:34 - おお 言及しませんでしたができれば蛋白レベルで確認されたほうがいいかと私も思います（もし最終産物が蛋白ならば）。

(無題) 削除/引用 No.9689-4 - 2021/05/19 (水) 00:13:00 - クェrちゅいおp＠ぎゅ 希望されるのはRNAレベルで十分な発現抑制が見られればよくて、そういう実験条件がわかればOKという理解でよろしいですか。タンパク質をコードしていない遺伝子ということでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.9689-3 - 2021/05/18 (火) 23:06:34 - おお Transfectionの効率が気になるところですね。 効率がある程度あるなら効く傾向のある２つを混ぜるとか、７２時間目に発現を確認するとか。 プライマーの設定はあなたのターゲットの発現が確実に確認できるものを選んでいるのならそれでいいと思います。

(無題) 削除/引用 No.9689-2 - 2021/05/18 (火) 20:19:18 - KD 細胞の播種とトランスフェクションを同時に行うリバーストランスフェクションを試してみてはいかがでしょうか？これでノックダウン効率が劇的に上昇した経験があります。

siRNAノックダウン効率が悪い 削除/引用 No.9689-1 - 2021/05/18 (火) 18:49:08 - 右 よろしくお願いいたします。 リアルタイムPCRにて高発現が確認された遺伝子を、Thermoのstealth RNAを使ってノックダウンしようとしています。 前日に撒いた細胞が７−８割コンフルエントになっていることを確認して、無血清培地で10nMに希釈したsiRNAと、lipofectamine RNAiMAX 1uLを混ぜ、5分室温放置したあと細胞にかけ、48時間後に回収し、ＲＮＡを取ってリアルタイムPCRでノックダウン効率をみています。 RNA濃度を40nM,100nMに増やして、その他は同じ条件でノックダウンを試みたこともあるのですが、全く落ちていなかったため、RNA節約のために10nMで条件検討を進めることにしました。 siRNAは3種類使っているのですが、どれもノックダウン効率が20-30％ほどだったり、あるいは発現が増えてしまっていることもあります。何か検討するべき条件などありますでしょうか？ また、ノックダウン効率を見る際のプライマーは、最初に発現をみた時のプライマーと同じものを使っています。siRNAごとにプライマー設計する必要があるのでしょうか？

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