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(無題) 削除/引用 No.9688-3 - 2021/05/18 (火) 10:32:44 - 独り言 CRISPR のスクリーニングが出始めた2013-2014年あたりにいくつかのラボがshRNAとCRISPRの比較されました。 例えば、 Genome-Scale CRISPR-Cas9 Knockout Screening in Human Cells とか。 個人的な解釈としては、shRNAよりもCRISPRのほうが欠損効果が強そう。shRNAだとノックダウンが中途半端で、フェノタイプがでていない細胞が多そう。 とか。 CRISPRのデメリットは必須遺伝子の場合は、スクリーニングできない。 だと思います。 shRNAのスクリーニングはあまり一般的に普及しなかったに対して、CRISPRのほうがすごく普及しているので、CRISPRのほうがフェノタイプがでるのだと思ってます。

(無題) 削除/引用 No.9688-2 - 2021/05/18 (火) 10:29:38 - asan 1. 目的のスクリーニング効果を見るにあたって、 KO phenotypeか抑制のphenotypeを対象としてるのか、ハンドリングしやすいかしにくいかの違い。RNAiならオフターゲットの議論も重要になる。 https://www.cell.com/cell/pdf/S0092-8674(18)30207-1.pdf のfig. 5 Eを見てもわかりますがshRNAのサイレンシングは結構off-targetはあります。また、十分な効果を期待するには、shRNAのライブラリーは質の良いものを入手する必要があります。 2. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5526071/ などをちゃんとよんで、まずはライブラリースクリーニングの成立条件を理解してください。 結局、統計的にスクリーニングが成立する方法を取れれば方法論としては理論上はなんでもいいです。 逆にいうと、プライマリーとか場合によってはin vivoでのバルクスクリーニングなんかで十分なrepresentationが得られない場合は数を絞ってやることは一般的です。

RNAi screening vs Cas9 screening 削除/引用 No.9688-1 - 2021/05/18 (火) 05:15:25 - Ken ある表現系に関わる遺伝子を同定するために、スクリーニングを計画しています。 網羅的にスクリーニングするために、RNAi libraryまたは、sgRNA導入+Cas9で遺伝子阻害した後で、ある表現系が残った（あるいは消失した）細胞群を集めて、次世代シークエンサーで解析する予定です。 1,様々な文献を調べているのですが、原理の違いは明確に記載されているのですが、経験則的な情報が少なく、sgRNAとRNAiの現実的な結果の違いには言及する論文はほとんどありません。どなたか結果の違いあるいは結果の出やすさの違いを経験された方いらっしゃいますでしょうか。 2.もう一つの質問としては、一度のbatchで扱う遺伝子数です。次世代シークエンサーで導入前と後のコンストラクトの頻度を比較する予定ですが、1度に全ての遺伝子を一度にウイルスベクターで導入する人が多いと思いますが、50分割あるいは100分割して入れる(つまり600遺伝子等細かく割ける)して解析される方もいるようです。後者のデメリットは手間だけですが、batchで扱う遺伝子数はどうやって決定されていますか？

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