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(無題) 削除/引用 No.9677-8 - 2021/05/14 (金) 16:52:40 - G25 コロニーが生えてくるのが遅い→液体培養で殖えてこない というパターンは、おおさんの仰る毒性のあるプラスミドコンストラクトのケースも考えられますね。組み込んだ遺伝子がleakyに発現してそれが大腸菌に毒性がある場合など。 対処法も含め、過去トピでもたびたび話題に上がっています。 培養温度を下げる（pUC系レプリコンではコピー数が下がる、発現を減速させる、）、 グルコースを加える（lacP下流にクローニングされている場合、lacPをリプレスする） などなど、 拾ったコロニーをいきなり液培しないで、選択プレート培地にストリークしてみましょう。間違って生えてきた非耐性菌ならまず再び生えてきません。増殖が遅くても歴とした耐性菌なら割と短時間で生えてるのが確認できるでしょう。 拾ったコロニーでコロニーPCRをしてみましょう。プラスミドを有しているなら、産物のバンドがゴリゴリに出るはず（偽陽性が出やすい実験だけれど、それならそれと感覚でわかるでしょう）。

(無題) 削除/引用 No.9677-6 - 2021/05/14 (金) 16:21:41 - G25 発色がおかしい（青のはずなのに白、白のはずなのに青、発色が異常に遅いなど）ということなら、みなさんの仰るケースもありえますが、 プレートで生えたコロニーが液培では殖えないというのは、抗生物質耐性でない→薬剤選択がうまく行っていなくてプラスミドが入っていない非形質転換体が生えた、ってことだと思います。 この先、ありがちなエピソードは 殖えるのが遅いのかなあと、殖えるまで振り続ける→数日後に濁ってくる→プラスミド精製→no yeild。つまり振り続けているうちに抗生物質がヘタって、非形質転換菌が殖えただけ。

(無題) 削除/引用 No.9677-5 - 2021/05/14 (金) 13:47:22 - おお まれにインサートが大腸菌の生育を阻害するような事があります。そういった場合はインサートがはいったプラスミドを持つコロニーは非常に生育が悪かったりします。そういう大腸菌は液体培地だと更に生育しにくかったりする場合もあります。 どういうことなら、そのコロニーを新しいプレートのに塗って、増えてきたときに掻き取ってミニプレップをしてインサートを確かめるのも手です。 大腸菌に対して毒性があるようなプラスミドはなるだけプラスミドコピー数を抑えるように、室温ぐらいで増やしたり、抗生物質の量を減らしたりして対処する事もあります。

(無題) 削除/引用 No.9677-4 - 2021/05/14 (金) 13:11:58 - noname o/nで培養したプレートを夕方までほおっておくと 白コロニーがだんだん青くなることは割とあります。 プレートはあんまり長く置かないほうが良いです。 もし丸一日以上培養しているといったことでなければ 培養のせいというよりはプラスミドの構築の時に 何か起こってしまっている可能性が高そうです。

(無題) 削除/引用 No.9677-3 - 2021/05/14 (金) 09:56:51 - G25 アンピシリン選択だと見ました。 耐性菌（あなたの言う青コロニー）の菌体からアンピシリンを分解するbeta-lactamaseが分泌され、その周囲から培地中のアンピシリンが分解されていきます。 アンピシリン濃度が下がれば、プラスミドをもたない非形質転換体も生えてきます。このコロニーはもちろん白色ですがアンピシリン耐性でないので、アンピシリン培地で培養しても殖えません。 インキュベートの時間がながくなるほど、広い範囲でアンピシリン濃度が下がり耐性菌のコロニーから離れたところでも非耐性菌が生えてきますが、比較的短時間でも耐性菌のコロニーを取り囲むようにぽつぽつと非形質転換体が遅れてコロニーを作りはじめます。いわゆる「サテライトコロニー」というやつです。

(無題) 削除/引用 No.9677-2 - 2021/05/14 (金) 09:34:32 - おお 15時間更に追加したということでしょうか？あまり培養が長いと酵母のコロニーが出てくることがよくあります。しかしまぁ見事に全部青だったんですか？普通はちょっとは白いもの（外れだけど大腸菌内で修復酵素などで削れたりしたけどつながったとか）があっても良さそうなんだけど。 もしかしたらInsertがIn frame で挿入されているにも関わらずLacZが働いているとか（比較的短いと特に起こりやすい）、白いコロニーも徐々に遅れて青くなってくることがあるので、見るタイミングが悪かったとか、、、

青白セレクション　培養時間 削除/引用 No.9677-1 - 2021/05/14 (金) 09:19:54 - 刹那 青白セレクションで、青コロニーしか生えてなかったので、試しに追加で15時間ほど塚で培養してみたところ、白コロニーが出てきました。 この白コロニーをミニカルチャーで培養したところ、増えていませんでした。 追加の培養が失敗の原因でしょうか？

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