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(無題) 削除/引用 No.9667-8 - 2021/05/11 (火) 17:26:58 - G25 昔はシリカ方式だとin vivo gradeの精製は無理で、やっぱイオン交換樹脂式じゃなきゃだめというのが常識でしたが（私もその伝でしたが）、最近ではシリカ方式でもパフォーマンスの良いものが出ています。イオン交換樹脂式はちょっと面倒なとこもありますしね（高塩濃度で溶出されるので溶媒交換が必要とか）。 先のレスでつけたリンク先のもそうです。Q社のEndoFreeプラスミド精製キットと同等かそれ以上の成績ということを口コミで伝え聞いたものです。side-by-sideで比較はしていませんが、たしかに感触は良いようです。 Q社はCsCl超遠心法にとってかわる精製カラムの草分け的存在で老舗中の老舗、30年以上同じ製品、同じプロトコールで生き残っているというのは（Endotoxin除去のステップなんかもうちょっと改良、洗練してもいいようにも思ったりして）、完成度が高い製品であったわけですが、、、 それだけ長い年月もあれば、後発でいい製品は出てきて当然のことなんだろうと思いました

(無題) 削除/引用 No.9667-6 - 2021/05/11 (火) 10:41:05 - asan >よりエンドトキシンの混入を防ぐplasmid精製kitがあることは承知しているのですが、精製scaleがMax以上と大きく、それほどDNA量が必要ではないため導入を思案しております。 midi レベルのものでも最近は売ってますけど？ https://catalog.takara-bio.co.jp/product/basic_info.php?unitid=U100006699 高いと言っても1カラム数千円で（しかも上のメーカーはたまに割引やってます）、インジェクションの方がはるかに金と時間のかかる実験をケチるってのは合理的ではないですね。 通常のグレードでもできないことはないと思いますが、確かにEFを使ってる人が多いと思いますよ。大量に余るのは捨てるだけです。ただ、CRISPRのKIはplasmidを使う方法はどっちみち効率が落ちます。産仔の数が本当にplasmidのエンドトキシンが理由なのかは不明です。 ちなみに、そんなに使わないからってスピン絡むの精製方法をつかってるならやめた方がいいですよ。小スケールのスピンのものは単なるシリカですけど、midi以上のちゃんとしたやつはイオン交換樹脂のものなのでどちらもtransfectionできますっていうキットはりますが、取れるDNAの純度は結構違います。 ちなみに受精卵は機械が必要ですけど、エレポが一番楽で効率がいいです。

(無題) 削除/引用 No.9667-5 - 2021/05/11 (火) 10:14:42 - AA NucleobondのMidiスケール精製キットを使っていますが、インジェクションするぶんはQIAquickのPCR purification kitで再度精製してから使っています。 出産の率はだいたい移植した胚の10-15%くらいです。 再精製を噛ませなくても発生が進むこともあるのでなんとも言えませんが、毒性だけではなくキャピラリー詰まりの対策も兼ねてやっています。 1回の実験で数匹しか産仔が得られないこともままありますが、ノックインが取れさえすればそれで良いかなと思っています。

(無題) 削除/引用 No.9667-4 - 2021/05/11 (火) 09:53:38 - P >>G25様 情報ありがとうございます。確かにThermofisherのweb page上ではMicroInjectionに対応していないと掲載されておりましたので私も気になっておりました。同じkit（もしくは同程度の精製grade kit(QIAGEN等））で精製したplasmidをMicroInjectionに供した際の発生率等の情報をお持ちの方がいれば教えて頂けないかと思いトピックを作成した次第です。 教えて頂いたkitは確かによさそうですね。検討してみようと思います。 >>ii様 エンドトキシン除去を目的とするならば、確かにTriton X-114で良さそうなのです。ただ、エンドトキシンの除去が胚発生率にどれほどクリティカルであるかどうか何か情報が無いかと思いこちらでお聞きした次第です。 コスト面や精製の手間も考えると、「手持ちのkitによる精製+Triron X-114」より「エンドトキシン除去stepを含む精製kit」の方が良いのかなと考えておりました。

(無題) 削除/引用 No.9667-3 - 2021/05/11 (火) 09:14:13 - ii エンドトキシン抜くだけならTriton X-114とかでもよいのでは

(無題) 削除/引用 No.9667-2 - 2021/05/10 (月) 17:59:43 - G25 microinjectionには推奨されていないシステムですね。 https://www.thermofisher.com/jp/ja/home/life-science/dna-rna-purification-analysis/plasmid-isolation/transfection-grade-dna.html これいいみたいですよ。 https://www.funakoshi.co.jp/contents/65412 ZymoPureIIの方ね。Midi scaleからあるし、価格もPureLinkと同じくらい（実売価は安いくらいかも）

マウス受精卵へのplasmid DNAマイクロインジェクション時の毒性 削除/引用 No.9667-1 - 2021/05/10 (月) 10:02:11 - Plasmid マウス受精卵へCRISPR-Cas9 RNP complexと共に、donor templateとしてplasmid DNAをマイクロインジェクションにより導入しGene targeting mouseの樹立を行っています。 plasmid DNAはInvitrogenの「PureLink HiPure Plasmid Miniprep or Midiprep kit」を用いて精製したものを使用しています。（インジェクション時の濃度は20ng/uLです。） インジェクション後仮親に移植し産仔を獲得するのですが、獲得産仔数が非常に少なく何か改善できる点は無いかと思案しております。 donor templateとしてplasmid DNAのようなdsDNAではなく、ssDNAやoligoDNAを使用できることは存じていますが、少し訳があってplasmid DNAでの導入を行っています。 少し気になっているのはplasmid DNA精製時に混入することが予想されるエンドトキシンによる毒性です。 受精卵へのマイクロインジェクションによるDNA導入の場合、上記kitによる精製は不適切なのでしょうか。 よりエンドトキシンの混入を防ぐplasmid精製kitがあることは承知しているのですが、精製scaleがMax以上と大きく、それほどDNA量が必要ではないため導入を思案しております。 マイクロインジェクション時のplasmid DNAの精製gradeについてご教授頂けませんでしょうか。 また、上記のようなplasmid kitにて精製したplasmidをsigma エンドトキシン除去試薬（Toriton X-114）のような製品を用いてさらに精製しマイクロインジェクションに供することはインジェクション胚の生存・発生率にどれほど有用なのでしょうか。 何か情報をお持ちでしたら、お教え頂けると幸いです。

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