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(無題) 削除/引用 No.9660-5 - 2021/05/07 (金) 17:16:01 - asan https://catalog.takara-bio.co.jp/product/basic_info.php?unitid=U100002661

(無題) 削除/引用 No.9660-4 - 2021/05/06 (木) 12:49:46 - toto 妙なものがでることは時々ありますね。原因を調べるのはそれなりに面白いかもしれないですが、プラスミド構築だけなら、NEBuilder HiFi DNA Assemblyのほうが遙かに楽です。レンチ作成のような繰り返し配列の多いもの以外ならば。Gibson assembly、InFusionと違って、NEBuilderになってからは、適当な制限酵素サイトがない場合、inversePCRを使わなくても、近くの制限酵素サイトを使ってぴったりin frameに入れ込むことができるようになりました。昔の苦労が嘘のようです。

(無題) 削除/引用 No.9660-3 - 2021/05/06 (木) 09:57:09 - G25 普段でもそういう例外的なクローンは出現しているのかもしれませんが、設計通りのクローンが大多数を占めるために見えてないだけかもしれません。 設計通りのクローンだと毒性があるなどして生えてこないこともあります。そういうときは生えてきて拾えるのは変異を起こして機能を失った例外的なクローンだけという結果になります。 そういう偶発的な「変異」の原因を追求してもメリットはないですが、 私が危惧するのは、あなたのトラブルがこのようなケースだとどんな方法でやり直しても正常なクローンを取るのは困難だろうということです。 毒性のベクターに対する対処法を考える必要があるかもしれません。 過去トピでもたびたび取り上げられていたはずだと思います。 ベクターの種類や宿主によりますけど、例えば 培養温度を下げるとか、leakyな発現を抑えるサプリメントを添加するとか、 可能ならベクターや宿主を変更するとか、、、、、、

(無題) 削除/引用 No.9660-2 - 2021/05/06 (木) 04:50:57 - おお 制限酵素で切り出してクローニングする方法は古典的であるけどもう半世紀と言ってもいいぐらい使われてきた手法です。なので変なことがおこって困るということはそうないことです。ただしまれに入りにくいという事に遭遇することはあります。入りにくいというのは系がしっかりとほぼベストな状態でワークしていてそれでも行き詰まる状態で、これを言うには系がしっかりしてなくては結論が出ないです。なのでこのような質問が出たとき、まずはあなたの系がどの程度ワークしているかという点についてのアドバイスが多くつくことがたいていです。過去のログを見てもらえばわかりますが、コンピテントの効率とか、ゲルから切り出したときUVを当てすぎてないかとか、、、 またBam HIの正確性は悪いケースでも、完全に切れる濃度より１０の３０乗倍過剰に加えると検出される程度です。グリセロールが過剰になると少し悪くなるでしょうけど、通常の条件では（最終容量の十分の１以下の酵素添加）問題にはならないはずです。 最近はそれでももっと正確性があるだろう商品がプロメガから出ています（BamHI-HF®とか）。気になるならそれを使えばいいかと思います。 大腸菌内にDNA修復機構やLigationなどDNA塩基を付け加えたりして応急処置をするようなメカニズムが存在しますのでプラスミドとインサートをLigationしてTransformationした結果、つなぎ目などの配列にModificationがあっても、使用した制限酵素やLigaseの仕業とも限りません。なので私なら質問のようなことが起こっても大腸菌内で何おこった可能性が高いと考えます。 もちろん方法論を変えるのは自由ですので乗り換えてもいいですけど。LigationやRecombinationに持っている前の段階でちゃんとしたものを用意してないとトラブルを繰り返す可能性はあります。

BamH1とNot1クローニング 削除/引用 No.9660-1 - 2021/05/06 (木) 03:02:26 - BamH! クローニングを行なっているものですが、GGATCCのBamH1サイト（とNot1）でベクターと遺伝子を消化し、ライゲートしたところ目的の遺伝子が取れず、代わりにトランケートのものがライゲートされていました。興味本位で配列を読むと、BamH1サイトのはずが、GGATTCになっていました。こういうことってあるんですね...遺伝子のGGATTCがBamH1で認識され、切断され、ベクターとライゲートされたのだと思います。ちなみにゲル消化した際の電気泳動はトランケートのような2つのバンドは見えませんでした。 もう一度行う予定ですが、制限酵素を用いたクローニングよりかはすべてのクローニングはHifi assemblyなどの騒動組換え方法に変えていくべきでしょうか。

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