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(無題) 削除/引用 No.9657-14 - 2021/05/07 (金) 14:02:32 - ！！！！！ 細胞分画してwesternしてみれば、どちらのデータが支持できるかある程度検証できる思う。通常は異なる手法で多角的に調べることが多い。一過性の強制発現は必ずしも本来の局在を反映しないことがあるので、内在性のもので見る必要はあると思う。Stable transfectant cell作成するときに発現レベルの異なる複数のクローンでその辺りを慎重に調べてから一番適切なクローンを選ぶことからもわかると思う。

(無題) 削除/引用 No.9657-13 - 2021/05/05 (水) 07:38:17 - おお それぞれの抗体の認識配列は確認したのだろうか。

(無題) 削除/引用 No.9657-12 - 2021/05/05 (水) 07:26:13 - medpf 論点は、FFPE vs frozenではなくて、蛍光染色とDABで異なる結果になるのが何故かという事ですよね。 確認しておきたいのは、２次抗体をどうされているかです。例えば、蛍光染色では蛍光ラベルした２次抗体を用い、DABではビオチン化２次抗体をストレプトアビジンHRPで検出する形であれば、両者の間にかなり違いがあるので、このあたりに原因があるかもしれません。 抗体AとCはモノクロ、Bはポリクロのようですが、モノクロはマウス、ポリクロはラビットで良いでしょうか？　あるいは、モノクロもラビットでしょうか？　要は、２次抗体が同じかどうかという事です。コントロールで用いているチュブリン抗体の動物種についても、気になるところです。全ての１次抗体に対し、同じ２次抗体を用いているならば、２次抗体そのものが原因とは考えにくいですけどね。 自分であれば、ポジコンであるチュブリン抗体と同じ動物種の抗体で検証します。２次抗体はDABでも蛍光でも同じHRPポリマーを用い、発色だけDABとTSA蛍光色素を使い分けて比較します。結果、その１次抗体ではどちらのメソッドでも核で染まるのであれば、内在性HRPによるアーチファクトを否定できれば、その１次抗体に結合するタンパク（目的のタンパクとは限らない）が核局在すると結論します。もし、どちらのメソッドでも細胞質で染まるなら、当初見られたDABによる核染色は内在性ビオチンによるアーチファクトの可能性を考えます（もしビオチン化２次抗体を使っているなら、ですが）。チュブリンの場合は高発現が予想されるので、内在性ビオチンによるバックグランドをはるかに超える染色が見られれば、核のアーチファクトはマスクされるかもしれません。チュブリン抗体は十分希釈して、DABの条件がお使いの抗体と同じになるよう調整した方が良いかもしれません。 ここまで条件をそろえても、お使いの抗体でのみ、DABでは核、蛍光では細胞質が染まるのであれば、ちょっと不思議ですが、逆に興味深くもありますね。

(無題) 削除/引用 No.9657-11 - 2021/05/04 (火) 15:49:06 - ぶん 免疫染色は全て凍結切片でしています。 長年やってて、それで困ることは、まあほぼ無い。 唯一、パラフィン切片の方が良いかもと思ったのは、 絨毛とかがある管腔状の臓器の切片で、数マイクロメートル ぐらいの薄切りでないと見れないところを見たい時だけ。 ひょっとしたら、凍結切片では駄目で、パラフィン切片でないと ワークしない抗体とかあるかもしれないけど、まあ無視してる。 もちろん光顕での話だ。

(無題) 削除/引用 No.9657-10 - 2021/05/04 (火) 10:54:39 - み 個人的にはFFPEのシグナルよりは凍結切片でのシグナルの方を信じるかな。 ホルマリン固定、パラフィン包埋、脱パラ、抗原賦活化などなど多段階を経て出したシグナルよりも生凍結切片をスライドに貼り付けて軽くPFAで固定しただけの方がartifact少ないと思っている。特に抗原賦活化方法の違いで全く異なるシグナルパターンを示すことは良くあるから、注意した方が良いでしょう。 全長蛋白にタグ付加して適当な培養細胞に強制発現させた場合、どんな染まり方しますか？ また、その強制発現細胞を3社の抗体で染めた時、タグ抗体と全く同じパターンで染まりますか？ 3社抗体はwesternでも正しいバンドを検出しますか？もちろん組織染色（高次構造を保持した蛋白）に使えてwestern（変性蛋白）では使えない抗体もあるけど、生化学的に精度よく細胞質・核を分画できるならwesternでのバンドの挙動も調べておいた方が良いかも。 まあ僕なら取り敢えず強制発現の分布をみる。

(無題) 削除/引用 No.9657-9 - 2021/05/04 (火) 09:26:25 - おお 細胞質にあることは全てで共通しているので主張できると思います。核に関しては染色だけではinconclusiveと言うしかありません。染まりぐわいもヒントとなると思いますが（繊維状に染まってるとか、ドットがたくさん見えるとか）そういうのの共通点、相違点は観察できますか？ 細胞質で機能するので核にあっては困ると言われても、核にあるのが事実ならそれは仕方ないし、他のグループが核で染まっているわけですから、細胞質だけにあることを主張するならそれをひっくり返せるくらいの何らかのデーターが必要です（おそらく染色以外の）。 核にあるわけないと思われている蛋白が実は核で発現していたりということはいろいろなタンパク質で発表がありますし、そこは柔軟に対応していけばいいと思います。実験のための仮説が成り立たない結果が出た場合、仮説が成り立つように持っていくよりも、仮説を修正しながら真実を追求するのが本来の研究だと思いますよ。

(無題) 削除/引用 No.9657-8 - 2021/05/04 (火) 07:10:20 - きこり これは知りませんでした。 情報ありがとうございます。 今回の私のケースは、DABを使った時には核が染まっていて、蛍光色素の場合は、DAPIとmutual exclusiveのような状態で染まらないという結果になっています。 実はもう一種類別の抗体もトライしているのですが、これは全体に染色が弱いので信頼性が乏しいですが、どちらかというと細胞質メインに見えます。 現状で、3つの抗体についてまとめると、 抗体 AmAb BpAb CmAb DAB　核 ◎ ◎ × 　　 細胞質 △　 △　 △ 蛍光 核　　　 ×　 ×　 × 　　 細胞質 ◎　 ◎　 △ こんな矛盾した結果になっています。抗体は会社が全く異なります。 アイソフォームがどうとかそういう細かいことも考えればいくらでも思いつくのですが、根本的な解決策を見いだすのが難しい状況です。 核の染色に関しては、他論文のsupplmentalデータでも確認出来るのですが、このタンパク質は基本的に細胞質で働いてしかるべきと予想しているので、核内発現が意外すぎて、これが本当なら実験プランが根本から変えようと思っているところです。

(無題) 削除/引用 No.9657-7 - 2021/05/04 (火) 06:47:27 - おお それは失礼いたしました。「基本的には細胞質に存在するはずです」とおっしゃっているので、アミノ酸配列にはっきりと核移行シグナルがないことを根拠にして断定しているのかと思いました。 私はあまり経験はないので細かいことは言えませんが、以下の文献では蛍光とDABで矛盾が生じることがあって、この場合は核のケースですが、hematoxylin counterstainが原因でDABで核の染色感度がこのケースにおいては低下したためと考えているようです。 例えばウエスタンブロッティングでもCBBで染色すれば検出感度が下がると言われています。Eosinが蛋白につくことが検出感度を変えることはあるでしょう。 https://www.nature.com/articles/labinvest201673.pdf?origin=ppub あなたの場合は核は両方で染色されているわけで核には観察できるということで現時点ではいいかもしれません。細胞質に局在する根拠が他にも揃うなら、蛍光のデーターを使っていけばいいのかと思います。いずれも何らかの検証もしていきながら確からしい結論を出していくものだと思います。 染め方や方法論で見え方が変わってくることがあり得るものだと色々聞いてはいますので、経験のある方が具体例を示していただけるものと思います。

(無題) 削除/引用 No.9657-6 - 2021/05/04 (火) 04:49:13 - きこり ですので、何も断定しない状態できています。

(無題) 削除/引用 No.9657-5 - 2021/05/04 (火) 03:34:57 - おお 核内移行シグナルがなくとも、核移行する蛋白に結合して核移行している例が示されています。蛋白の配列だけで局在を断定するのは危険です。

(無題) 削除/引用 No.9657-4 - 2021/05/04 (火) 03:17:31 - きこり ターゲットの抗体は機能が未知で、基本的には細胞質に存在するはずです。 しかしながら、核内移行シグナルを検出するソフトをかけると、わずかに核移行シグナルにも見えなくもない配列があります。ただし3つソフトにかけても1つのみで検出できるので、明確な核内移行シグナルとも断定できません。

(無題) 削除/引用 No.9657-3 - 2021/05/04 (火) 03:15:30 - きこり 染色コントロールはtubulinです。細胞骨格に関連する因子を染めているので、tubulinを今は選択しています。

(無題) 削除/引用 No.9657-2 - 2021/05/04 (火) 03:00:45 - おお >コントロールの抗体では、どちらの染色法でも細胞質に染まります。 これは具体的に何を染めているのですか？染まっては行けない抗体で染まっているという印象ですが。

染色結果の不一致 削除/引用 No.9657-1 - 2021/05/04 (火) 02:37:59 - きこり 人の組織を用いて染色を行っています。FFPE切片を元にDABで染色を行うと核に局在しますが、蛍光染色を行うと細胞質が中心になります。同じ現象を2種類の抗体で確認しています。どちらの局在が正しいのか悩んでいます。何かアドバイスありますでしょうか。 コントロールの抗体では、どちらの染色法でも細胞質に染まります。

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