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(無題) 削除/引用 No.9647-22 - 2021/05/05 (水) 23:41:00 - aa ＞ど素人さん ど素人さんやぶんさんがコメントしていただきましたように、チューブを使えば接着細胞に表面に細菌を接した状態にできそうな気がしていました。プレートを使わなくてはいけないと思い込んでいたので、コメントしていただきましてありがとうございます。 はがし方ですが、 accutaseは知らなかったので、検討をしてみたいと思います。EDTAについては、やったことがありまして、今回、使用する細胞でははがれませんでした。はがし方が課題になりそうかと思っていまして、セルスクレーパと比較してaccutaseでデータに影響があるかないか検討をしてみたいと思います。

(無題) 削除/引用 No.9647-21 - 2021/05/05 (水) 22:12:43 - ど素人 4.5 ml の細胞培養チューブというのもあったので念のためご紹介します。 https://shop.gbo.com/en/row/products/bioscience/cell-culture-products/cellstar-cell-culture-tubes/120190.html 先にご紹介した 16 ml と比べると一長一短かと思います。 まず、 4.5 ml 細胞培養チューブは 1000 μl のピペットマンで操作できると思われます。これは扱いやすさという意味では優れています。しかし、底面積は狭くなるので接着できる細胞数は少なくなると思われます。一方 16 ml ではそこそこの底面積があると思われますが、マイクロピペッターではなく 1 ml ないしは 2 ml のピペットで操作する必要があると思われます。 最近ではトリプシンを用いず accutase を用いて細胞を剥すことも多いです。以下など。 https://www.nacalai.co.jp/products/entry/d001011.html また、場合によっては一切酵素を用いず、PBS+EDTAで剥せる細胞もあります。この辺はご自身での条件検討が必要です。

(無題) 削除/引用 No.9647-20 - 2021/05/05 (水) 20:56:47 - aa ＞ぶんさん コメントありがとうございます。紹介していただいたようなチューブがあるとは知りませんでした。今回は、底に接着している細胞に、細菌を接したような状態にしたいので、目的に即して使用できるかどうかといった問題があります。しかし、こういったチューブは知りませんでしたので、おもしろいと思います。今後の参考にさせていただきます。

(無題) 削除/引用 No.9647-19 - 2021/05/05 (水) 04:22:09 - ぶん 使ったことないけど、こんなのも売ってる https://www.bmbio.com/shop/g/g391243/

(無題) 削除/引用 No.9647-18 - 2021/05/05 (水) 00:51:45 - aa 文字化けが起こりました。 チューブでも細胞を剝がす方法があればよいのですが、できればトリプシンなどは使いたくなく、物理的に剝ぎ取りたいと考えております。 →チューブでも細胞をはがす方法があればよいのですが、できればトリプシンなどは使いたくなく、物理的にはぎ取りたいと考えております。 訂正します。

(無題) 削除/引用 No.9647-17 - 2021/05/05 (水) 00:48:45 - aa ＞ど素人さん コメントしていただきましてありがとうございます。 チューブで培養すれば遠心できますね。思いつかなかったので、いいアイデアだと思います。プレートでは、細胞を回収する時に、セルスクレーパーを使用するつもりでした。チューブでも細胞を剝がす方法があればよいのですが、できればトリプシンなどは使いたくなく、物理的に剝ぎ取りたいと考えております。 ＞もしプレートでやるなら、遠心の代わりに細菌の濃度の検討で解決できないのだろうか? 細菌の濃度についても検討してみたいと思います。 元ボスや関連論文については、詳しく調べてみます。 細胞と細菌の相互作用は、詳しくは答えれませんが、細胞接着分子を考えております。

(無題) 削除/引用 No.9647-16 - 2021/05/04 (火) 21:15:49 - ど素人 元ボスのお考えは分かりませんし、aa様の研究に関しても素人なので分かりません。だから教えるということはできませんけれども。 もし、遠心することが本当に必要条件だとしたら、自分なら培養チューブの利用を考えるかもしれません。 6 well だと例えスイングローターでも液はねしそうな気がしてしまうので (気のせいかもしれませんが)。6 well を PCR 用の小型遠心機で遠心というのは、滅菌シールを使ったとしてもうまくいくかどうか.... もし平底である必要性がないなら、5ml の FACS チューブと同系のもの、または 14 ml、16 ml などの培養チューブを用いれば、普通のスイングローターで遠心できるような気がします。 Corning 16 x 125 mm Culture Tubes, TC-treated https://ecatalog.corning.com/life-sciences/b2b/JP/en/General-Labware/Tubes/Tubes,-Round-Bottom/Corning%C2%AE-Culture-Tubes/p/430172 もしプレートでやるなら、遠心の代わりに細菌の濃度の検討で解決できないのだろうか? という疑問はあります。もちろん、お教えすることはできなくて、疑問に思うだけです。遠心をすることでうまくいくかどうかというのは、実際にその実験の経験がないと答えられないと思います。 その他気になる点 1. 元ボスの関連研究は論文になっているのか。また、類似した研究に関する他の論文では遠心しているのかどうか。 2. 細菌とマクロファージの相互作用はどのような分子機序を想定しているのか (秘密であれば開示いただく必要はありません)。

(無題) 削除/引用 No.9647-15 - 2021/05/04 (火) 20:31:28 - aa ＞ぶんさん コメントありがとうございます。 ＞たぶん、一番シンプルで、簡単な方法で十分だと思うけどね。 スピンダウンしなくても大丈夫ということでしょうか？ 詳しく教えていただきますと幸いです。 また、いくつか前のメッセージでありました滅菌の問題ですが、滅菌したシール が売っていたので、短時間の培養でない場合は、滅菌シールの使用も検討しております。

(無題) 削除/引用 No.9647-14 - 2021/05/04 (火) 15:50:42 - ぶん たぶん、一番シンプルで、簡単な方法で十分だと思うけどね。

(無題) 削除/引用 No.9647-13 - 2021/05/04 (火) 15:17:36 - aa >asanさん コメントありがとうございます。 共通の予算で買えればよいのですが、共通予算が少ないため、すぐに買ってもらうのは、なかなか難しいところです。なので、節約？の方法があればよいかなと思いまして、書き込みをいたしました。 細胞ですが、接着しているマクロファージ様細胞を使用する予定です。ただ、浮遊細胞の使用も考えてはおりますので、その場合、コラーゲンコートもいいかもしれませんね。 遠心して細菌を底に落として、接着細胞の表面に接した状態にしたかったのですが、遠心した時としなかった時にどれぐらいデータに違いがあるのかは実験してデータをとったことはありません。だた、前の職場で働いたときにボスに、細菌をプレートに入れたときは、スピンダウンして下さいと言われたことがあったので、やったほうが良いのかなと思ってはいるのですが…しなくてもよいのならそれでも良いかとは思います。

(無題) 削除/引用 No.9647-12 - 2021/05/03 (月) 19:29:25 - asan 培養細胞ならやっぱりスイングローターでスピンするしかないと思いますけどね。 かりに特殊な方法でできたとしても、培養する細胞をgも曖昧な方法でスピンするってのは個人的にはやりたくないですけどね。 それが無理なら、通常はコラーゲンコート（Cell matrixとか)を自分でするとか、ちょっと特殊なプレートに細胞自体を撒いて接着を促進させて実験すると思います。 10万はきついですが20万ぐらい出せばスイングローター売ってる遠心機とか共通機器とかふくめてないんですかね？それを所内の予算で一部負担してもらって相談するとか。 ちなみにT細胞の上皮細胞共培養とかやってますけど、普通に置いておけば浮遊細胞でもだいたい底に沈んできませんか？そこまで厳密な時間コントロールが必要なもんですかね？

(無題) 削除/引用 No.9647-11 - 2021/05/03 (月) 19:04:42 - aa 間違えました。 マクロマージ用細胞 →マクロファージ様細胞 ですね。すみません。訂正します。

(無題) 削除/引用 No.9647-10 - 2021/05/03 (月) 16:27:25 - aa ＞ど素人さん コメントありがとうございます。 私が行いたい実験は、マクロマージ用細胞における細菌の貪食に関わる因子を見るというものです。 培地中に細菌が漂っている状態ではなく、スピンダウンによって培養細胞の表面に細菌が接している（近い）ような状態にしたいのです。そこが、実験開始時間という考え方です。 もし他に良い方法があるのであれば教えていただけますと幸いです。 また、「くっつく」という表現は、ある程度接しているという意味で使ったつもりでした。この点についても、間違いでしたら教えていただきますと幸いです。 よろしくお願いいたします。

(無題) 削除/引用 No.9647-9 - 2021/05/03 (月) 12:55:56 - ど素人 その分野の素人からみて少し気になるのが、細菌の哺乳動物細胞への影響を解析するのに本当にスピンダウンが適した手法なのかどうか、ということですが.... 過去細菌と哺乳動物細胞との共培養というような研究は様々行われているのではないかと思うのですが、実際にスピンダウンしないと研究が成立しないのでしょうか。 スピンダウンすれば細菌が細胞の表面にくっつく、というのが、ホントかな? と感じてしまったもので....

(無題) 削除/引用 No.9647-8 - 2021/05/02 (日) 23:42:09 - aa ＞UUさん コメントありがとうございます。 通気性のあるシートがあるとは知りませんでした。 シールをはがさないで、培養できるのは便利ですね。 検討してみたいと思います。 ＞ぶんさん コメントありがとうございます。 今回は、培地に細菌を入れて、培養細胞の表面に細菌をくっつけないといけないので、スピンダウンなしは難しいかもしれません。 しかし、コメントしていただいたことから、思いついたことがあります。ウェルいっぱいに培地を入れシールをすれば、スピンダウン後に、培地が底に対して垂直になることはないのではと思いましたので、この方法を試してみようかと思います。 また、試しに使用済み96ウェルプレートに、水100μlを入れ、垂直にしたところ、表面張力？で、水はこぼれませんでした。96ウェルならPCRプレート用の遠心機でもスピンダウンできるかもしれません。しかし、もっと大きいウェル、例えば6ウェルでは、水がこぼれてしまうので、ウェルいっぱいに培地を入れてシールをして遠心でないと、スピンダウンは難しいかなと思いました。ただ、培地を多めに使ってしまうという短所がありますが。

(無題) 削除/引用 No.9647-7 - 2021/05/02 (日) 22:17:36 - ぶん あるいは逆転の発想で、絶対にスピンダウンが不要なように実験をデザインする。 たとえば、 (1)ウェル満杯の液量にする (2)ウェルに液を添加する時には水面にチップ先を入れて、 ウェル壁に置かない

(無題) 削除/引用 No.9647-6 - 2021/05/02 (日) 21:35:00 - uu breathable sheet というものがあります。 https://www.thomassci.com/Molecular-Diagnostics/Amplification/PCR/Plate-Sealing/_/Breathe-Easy-Sealing-Film?q=Breathable%20Sealing%20Film これを貼って、遠心してそのまま培養すればいいかも。 通常のプラスチック蓋で生じる外周wellのedge効果を無くす目的で使っていました。 遠心時にsheetも培地で若干濡れると思いますが、 それによる通気性への影響と、最近のsheetへの付着がどの程度生じるかは分かりません。

(無題) 削除/引用 No.9647-5 - 2021/05/02 (日) 18:26:53 - ぶん 培養プレートはフラット底で、遠心するには、スイングローター。 PCRプレートは、U字底で、液量も少しだから、スイングローター である必要は必須でない。 そこをあえてやろうとすれば、何らかの工夫や妥協は必要でしょうね。 たとえば液量をすごく減らして、シールしてスピンダウン。そのあとに 液量アップとかかな。培養時間短ければ、シールの滅菌は気にしない。

(無題) 削除/引用 No.9647-4 - 2021/05/02 (日) 17:25:35 - aa 追加ですが、PCRプレート用の遠心機で、培養細胞をスピンダウンした人がいたら、しっかりできたかどうか教えていただきますと幸いです。 遠心している時は、プレートの底に、培地が移動すると思いますが、取り出すときに、PCRプレート用の遠心機は、プレートが垂直になるので、培地がプレートの底に移動しておらず、底に対して培地が垂直になってしまうのではないかなあと思いました。 専用の遠心機を買えばよいことなのですが、よろしくお願いいたします。

(無題) 削除/引用 No.9647-3 - 2021/05/02 (日) 13:02:53 - aa ＞ど素人さん コメントありがとうございます。 私の実験ですが、細菌を培養細胞に添加して影響を解析するというものです。なので、プレートを遠心して、細菌を培養細胞の表面にくっつけたところからが、実験開始時間ということになります。 コメントしていただきましたように、PCRプレート用の遠心機は、垂直に傾けなくては、スピンダウンができません。なので、培養細胞のプレートでは、垂直にすると培地がこぼれてしまいます。 ただ、コメントをしていただきまして、思いついたのですが、スピンダウンする時だけ培養細胞のプレートにシールをして、PCRプレート用の遠心機でスピンダウン後、シールをはがして、プラスチックのふたをして培養するということもできるかなと思いました。 ただ、シールは滅菌したほうが良いのかなと思ったのですが、短時間の培養なら良いかとも思いました。 シールを滅菌する方法をご存じな方がいらっしゃいましたら、コメントしていただけましたら幸いです。

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