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(無題) 削除/引用 No.9646-9 - 2021/05/09 (日) 05:13:24 - あの 下流のプロトコル次第では、フリーのビオチンが残っていても問題ない。

(無題) 削除/引用 No.9646-8 - 2021/05/08 (土) 20:28:43 - U フリーのビオチンなら透析で除去できるのではないかと。最近はマイクロリットルスケールの試料用の微量透析もあります。溶出後に溶出画分を適当な(ビオチンなしの）bufferで（透析しやすいvolumeになるよう）希釈→適当なbuffer（1mlに対して1L, 5時間以上)に透析してビオチン除去→TCA沈殿→遠心→アセトン洗浄→SDS-sample bufferに溶かす→電気泳動　とかも有りと思う。不安定なタンパク質とか、濃度が希薄とかで透析でロスするのが心配ならば市販のエコノミータイプの脱塩カラムとか脱塩用スピンカラム、遠心濃縮チューブなども使用できる。そういうのはたぶんbiotin除去のための使用例とかもあると思う。

(無題) 削除/引用 No.9646-7 - 2021/05/06 (木) 15:49:40 - tk 皆さま、様々なアドバイスありがとうございます。 参考にさせていただきます。

(無題) 削除/引用 No.9646-6 - 2021/04/29 (木) 16:37:13 - ii 経験的には、StreptagをStreptactinから外すのに、50 mMなどという高濃度のビオチンは必要ないです。Tandem-strep-tag-IIをStreptactin XTにくっ付けて、50 mM Tris-HCl containing 200 mM NaCl and 0-50 mM D-biotin (pH 8.0) のグラジエントで溶出してみたところ、15 mM辺りで十分外れてきました。わりかし濃度変化の速いグラジエントだったので、もしかしたらもっと低濃度でも外れるのかもしれません。 またタンパク質が沈殿しない程度の弱めの酸性下でビオチンだけ析出させて除くみたいなことが出来るかもしれませんね。

(無題) 削除/引用 No.9646-5 - 2021/04/29 (木) 04:51:31 - おお ビオチンはCOOHがあってその電荷が大きく溶解性に影響するようです。酸性下では非常に溶解しにくいのでTCAでは沈殿したあとの残留TCAの強い酸性がいろいろな意味で影響します。またトリクロロ化合物はトリプトファンと反応しますので若干の不安があります。 わたしはTCAを使うなら有機溶媒系のほうがいいのかもと思います。有名なのがアセトンで、４倍量の冷アセトンを加えて遠心するだけです。溶解方法はサンプルバッファーのようなものでもいいですが、沈殿が溶けにくいのであれば６M尿素を含むバッファーを使うのがよいかと。ん、尿素使うとボイルできないから、サンプルバッファーでボイルのあとの残渣を尿素で回収したほうがいいか。サンプルバッファーはオリジナルはpH６.８だけど、８以上に上げたほうがいいかもね。

(無題) 削除/引用 No.9646-4 - 2021/04/29 (木) 00:35:41 - U1 pHはどうでしょうか 50 mM Biotin stockを作るとき、ミリQだと溶けないので 10 mM Tris-HCl pH 8に溶かしています。 100 mM Trisとは言え、TCAの影響で酸性に傾いているでしょうから NaOHでpH調整してみてはいかがでしょう。

(無題) 削除/引用 No.9646-3 - 2021/04/28 (水) 18:49:37 - TN 透析、もしくはAmiconなどのUltrafiltrationカラムはいかがでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.9646-2 - 2021/04/28 (水) 17:48:17 - PE 一般的な溶出物質である2mM程度のデスチオビオチンで試すのはどうでしょうか。ちょっと高いですが。 あとは、溶出画分のタンパク質濃度を測ってみて、ちゃんと取れてるのを確認するべきかと。 デスチオビオチンが有ってもPAGEが上手くいかない経験はしたことないですね。 濃縮に関しては、構造が壊れてもいい実験系だと認識してますが、無難に限外ろ過を使われるのが良いと思います。

Strepタグによる精製後のタンパク質の濃縮・ビオチンの除去 削除/引用 No.9646-1 - 2021/04/28 (水) 17:14:16 - tk あるタンパク質にStrepタグを融合して出芽酵母に発現させ、Strepタグ/Strep tactin系でタンパク質を精製した後に、得られたEluteフラクションを濃縮したいと考えています。 TCA沈殿で濃縮しようとしたところ、（おそらく）ビオチンが沈殿してしまい再溶解が困難でした。 無理矢理再溶解させてSDS-PAGEを行いましたが、泳動像が乱れ（濃縮ゲルでfront dyeがぼやける・隣のレーンのマーカーが圧縮される程度にサンプルにタンパクが含まれていると思われたが目的のタンパク質はCBBで染まらない等）、しばらく室温で放置しておくとサンプルからビオチンが析出してきました。 そこで濃縮前のEluteフラクションをサンプルバッファーと混合してSDS-PAGEを行いましたが、同様に泳動はうまくいきませんでした。 SDS-PAGEサンプルにビオチンが多量に含まれているとうまく泳動できないのでしょうか。 またそうだとしたら、Eluteフラクションからビオチンを除き、タンパク質を濃縮できる方法はあるでしょうか。 Eluteバッファーの組成は100 mM Tris/150 mM NaCl/1 mM EDTA/50 mM Biotinです。

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