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追加情報ありがとうございます。 削除/引用 No.9639-11 - 2021/05/15 (土) 11:29:28 - さくら しばらく見ていなかったうちに、さらに情報ありがとうございます。 大変助かります！ 現在の実験では、サイトスピンは500rpm、3分で行いました。 懸濁液は100〜200μlです。 確かに今回テストした細胞株はまあまあ頑丈なほうなので、それでBSAでうまくいった（といってもやはりノーダメージではなく比較的という意味ですが）という可能性が大いにありますね。 私のメインの目的は、iPSから分化させた血球の観察ですので、細胞株よりはかなり繊細になると思います。 となると、medpf様ととおりすがりのもの様の経験を参考にFBSに懸濁するのが最善のようですね。 ほかの細胞株や、ヒトPBMCなどでもう少し検討してみます。 貧乏性でコストを削ろうとしましたが、どう考えても使用するFBSのコスト＜血球分化させるコストですので、そこはケチらず行こうと思います！

(無題) 削除/引用 No.9639-10 - 2021/05/02 (日) 17:40:49 - とおりすがりのもの 普通の接着系のがん細胞（A549とか）でも、トリプシン処理してFBSで懸濁すればサイトスピンにできるので、試し見ると良いかもしれませんね、

(無題) 削除/引用 No.9639-9 - 2021/05/02 (日) 17:37:34 - とおりすがりのもの まず500回転5分くらいで落として、PBSは一切使わず、FBS１００％です。 そのあとサイトスピンですが、ちょっと今、家なのでサイトスピンの回転速度の資料がないので、連休明けに開示します。 スピンする液量は２００uLくらいでしょうか。 サーモのサイトスピンはろ紙に裏表があるので 一応気にしています。 （スパっと切れている面がスライドガラスに張り付くように）

(無題) 削除/引用 No.9639-8 - 2021/05/02 (日) 17:31:24 - とおりすがりのもの ところでサイトスピンの回転速度と時間は開示できますか？

(無題) 削除/引用 No.9639-7 - 2021/05/02 (日) 14:52:41 - medpf 前回のコメントの言葉が足らなかったようで、申し訳ありません。 基本的なコンセプトとしては、血液や骨髄液のスメアで問題がないのに、 細胞懸濁液ではなぜ上手くいかないのかという事です。 乾燥の過程で細胞周囲の浸透圧が上がることが細胞ダメージの原因と推測しており、 ヒトの血液や骨髄液には、それを防ぐ何かが含まれていると予想しています。 私自身は血液内科医で、ヒト骨髄や血液のスメアには何の問題もなかったのですが、 留学中のプロジェクトでマウスの骨髄細胞をBSA含むPBS中に採取してサイトスピンすると、 細胞形態が相当のダメージを受ける経験をしたため、試行錯誤した事があります。 マウス自家血清を採取し、細胞懸濁液に50%で加えることで血液に近い環境にすることで、 ある程度解決しました。 なので、BSA+PBSはお勧めしません。 FBSで少なくとも50%までは上げた方が良いと思います。 No.9639-2の方はおそらく100%FBSでやっていると思います。

(無題) 削除/引用 No.9639-6 - 2021/05/02 (日) 13:45:24 - さくら 簡単にテストしてみましたところ、細胞懸濁液をFBSや1%BSA/PBS(-)で作成したところ、PBS(-)よりもやや形態の変形がましになったように思います。（風乾やや優し目にしてみました） FBSとBSAどちらがというところまで詳細には検討できていませんが、以降はこのどちらかで行ってみようと思います。 ちなみに1%BSA/PBS(-)、10%BSA/PBS(-)、1%BSA/DW、10%BSA/DWの4つで条件を振りましたが、DWは当然ながら細胞は跡形もなく破壊され、PBSは1%でも10%でも大差ありませんでした。 ので、実際行うとすればFBSか1%BSA/PBS(-)が妥当かなと思われます。 今回はサイトスピンで検討しましたので、次の機会にFBSとBSAでスメアを引いてみての検討もしてみたいと思います。 ひとまずではありましが、お知恵をくださってありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.9639-5 - 2021/04/25 (日) 11:23:21 - さくら お三方ありがとうございます。 特に深く考えずに細胞をPBSに懸濁していましたが、確かにそれだと細胞にはあまり優しくなかったかもしれません。 アドバイスをいただいたFBSと、あとはBSAなども検討して、それでも問題ありなら、引用していただいたメタ固定なども試してみようと思います。 また、今回は浮遊細胞ですのでdishそのまま染色に移行というとこができないのですが、付着細胞で同様の作業を行う際にはその手も考えてみます。 検討後、ご報告させていただきます。

(無題) 削除/引用 No.9639-4 - 2021/04/25 (日) 06:26:53 - それ そもそも細胞を剥がさずに、観察できるウェルとか使えば、 細胞を剥がす必要がなくなって、プロトコルを簡素、迅速に できないですか？

(無題) 削除/引用 No.9639-3 - 2021/04/24 (土) 14:04:29 - medpf 細胞によってはサイトスピンで形態が崩れる場合があります。 血液のスメアでうまくいっているなら、細胞株もスメアにすると良いかと思います。 私もPBSでの懸濁はお勧めしません（乾燥時にいろいろトラブルが起きます）。 風乾の方法には多少議論がありますが、個人的には冷風ドライヤーで大丈夫と思っています。 個人的には、培養造血細胞のギムザ染色で風乾前固定をした事はありませんが、 過去ログを見ると、付着性の培養細胞では乾燥させずにメタノール固定した方が良いようです。 http://kenkyuu2.net/cgi-biotech2/biotechforum.cgi?mode=view;Code=886

(無題) 削除/引用 No.9639-2 - 2021/04/24 (土) 13:35:44 - とおりすがりのもの HL60などですが、私は血液内科医の教授に 懸濁はFBSで行うようにならいました。 試薬は武藤化学、機械は サイトスピンです。 ドライヤーは使わず、ミニ扇風機 スライドガラスは松並 水洗や染色はスポイトで徐々に置き換えていく感じです。

培養した血液細胞のギムザ染色 削除/引用 No.9639-1 - 2021/04/24 (土) 13:28:42 - さくら 培養細胞のメイ・ギムザ染色に躓いております。アドバイスをいただきたいです。 白血病系のcell lineやiPS細胞から分化させた血液細胞をメイ・ギムザ染色して観察しようとしていますが、細胞の形態が壊れてしまいうまく観察できません。 実際に行っている手順としては、以下の通りです。 １、回収した細胞をPBS(-)に浮遊させて適量をcytpspinでスライドグラスに付着させる。 ２、ドライヤー（冷風）で風乾 ３、メイ液１分 ４、バッファー等量追加で１分 ５、水洗 ６、ギムザ希釈液１５分 ７、水洗 ８、ドライヤー（冷風）で風乾 以上のような手順で行っています。 手順をいくつかの論文で調べたところ、おおむね「cytospinでスライドグラスに付着させてギムザ染色をした」という以上のことは記述されておりませんでしたので、ひとまず血液の薄層塗抹標本とおなじ手順で行ってみた結果、上記の通り現在失敗続きです。 薄層塗抹標本でのギムザ染色では問題なく染色されていますので、おそらくそれ以前の問題だろと考えております。 今考えている方法としては、サイトスピンにかける前に何らかの固定をしたほうがいいのかな、というくらいしか思いつかないのですが、なにか良い方法をご存じの方、あるいはちょっとしたアイデアをお持ちのかた、アドバイスを頂けないでしょうか。

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