全20件 ( 1 〜 20 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

(無題) 削除/引用 No.9637-20 - 2021/05/17 (月) 21:32:17 - 生物系院のM1です みさん ありがとうございます！！！！ とにかくnを積めばいいやという態度が自分の中にあったので非常に反省しています。 ちょっとCBBでのトランスファーがうまくいったかのチェックだとか、しっかりやっていこうと思います！！ ウエスタンも今度流すときは数枚ゲルを複製して場所も並び替えてやってみます！！

(無題) 削除/引用 No.9637-19 - 2021/05/17 (月) 20:07:09 - 生物系院のM1です ぶんさん そうですね.....細胞は単にコンフルした時に取ってきているので考えておりませんでした。。 ご指摘ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.9637-18 - 2021/05/17 (月) 20:05:52 - 生物系院のM1です BCGさん ありがとうございます。 『いつでも絶対に量が不変であると保証付きの特定のタンパク質なんてそんなんもの誰にもわからないわけで』という言葉、かなり刺さります。 教官からも、『一応再現実験でやっているから、ローディングコントロールがでないのはまあ問題ではあるけれど、そもそもローディングコントロールをしつこく追求する流れも最近はないので、こだわりすぎるのも問題ですよ。』と何度も言われているので、この掲示板でご指摘していただいたことをやって無理だったらあまり深入りしないようにします。。。。

(無題) 削除/引用 No.9637-17 - 2021/05/17 (月) 19:56:24 - 生物系院のM1です GWさん コメントありがとうございます！！ そうですね....一応アプライ量は１レーンあたり4μL(BCAしてのち1μg/μLに濃度調整したサンプル）と周りの先輩や同輩の実験プロトコールと比べても少ない方なので、あまり量が多すぎて外れるということはないのかなという風に考えております。。。もしかして、弊ラボのみんなが全体的にアプライ量多い感じなのですかね、、、、

(無題) 削除/引用 No.9637-16 - 2021/05/17 (月) 19:50:46 - 生物系院のM1です ぽーさん アドバイス本当にありがとうございます！！ そうですよね！ウエスタン関連の手技の問題なのかそれ以前のサンプルの問題なのか、細胞自体の問題なのかはっきりさせるところからですよね.....先輩に頼んでみます！！！

(無題) 削除/引用 No.9637-15 - 2021/05/17 (月) 19:43:26 - 生物系院のM1です medpfさん コメントありがとうございます！！ メンブレンはpvdfを使っていますね。。。。 CBBやamido-blackについては、（かなり基本的な手法とお伺いしていますが）あまりこのラボでやったことある人がいないので教官に聞きつつ一緒にやってみようと思います！！

(無題) 削除/引用 No.9637-14 - 2021/05/03 (月) 01:04:55 - GW それ、もしかして量が多すぎて洗浄中に膜から外れてないですか？ハウスキーピングたんぱく質（そもそもこんな名前つけた人は誰よとか思うんだがまあいい）とかって量が半端なく多いので、本来の見たいたんぱく質を見れるように添加量合わせると、どうしても大過剰になりがちで、それが原因で膜の吸着容量超えて転写される結果お正月のお供え餅状態になって抗体が結合した再外側が洗浄中に外れる。その結果変な感じで染まらなくなる。この外れ方は偶然に左右されバラバラなのでその度ごとに違う。

(無題) 削除/引用 No.9637-13 - 2021/04/30 (金) 13:21:29 - おお PVDFで抜けやすい蛋白もあるのですね。TOM20とかはニトロセルロースで抜けやすかった。そういうのが理由でPVDFを使うようになった。

(無題) 削除/引用 No.9637-12 - 2021/04/30 (金) 12:56:40 - ぽー 自分で作ったサンプルを他の人にWBをしてもらってみては？ 逆に、他の人が作ったサンプルを自分でWBをしてみるとか。 その結果によってサンプルの問題なのか、それ以降の手技的な問題なのかは明らかになると思います。

(無題) 削除/引用 No.9637-11 - 2021/04/30 (金) 12:49:28 - み >[Re:10] おおさんは書きました : > > 低分子が抜け落ちないようにPVDFを使えばなおいいでしょう。 > 私の経験では低分子量はニトロセルロースの方が保持されことが多い。 確かAベータもPVDFは抜けやすい代表例だったような。 まあ今回はインターナルコントロールの不揃いが問題ではあるが。

(無題) 削除/引用 No.9637-10 - 2021/04/30 (金) 06:32:08 - おお >[Re:8] 生物系院のM1ですさんは書きました : > おおさん > コメントありがとうございます！目的タンパクとしてAβを見ているのでGAPDHのような重めのタンパクは写りにくいという可能性に気づいておりませんでした、、、 むかしからあるWetのTransferであれば、低電圧でOver nightのTransferがベターかも知れません。低分子が抜け落ちないようにPVDFを使えばなおいいでしょう。 あまりインターナルコントロールにてを取られるようだったら、お示ししたようにPonceauSなどの染色で済ませたほうがいいかもしれません。ただしゲル濃度が高いので殆どのバンドが上の方でスタックしていてちょっと見づらいかもしれませんので、１０％ぐらいの別のゲルを用意して、同量ローディングしてCBB染色で示してもいいかと思います。もしろん１０％の方もTransferしてアクチンなどで染めるのもありだけど。

(無題) 削除/引用 No.9637-9 - 2021/04/29 (木) 23:57:40 - 生物系院のM1です ふらいむさま コメントありがとうございます！ ブロッティングの機械は全員が共通して使っているものなのですが、僕以外でローディングコントロールがうまく出ないという声は聞いたことがなく、、、 むしろ「なんでお前だけ上手く出ないの？」みたいな顔されてしまいます...泣 やはり手技orサンプルの気がしてきました。。。。

(無題) 削除/引用 No.9637-8 - 2021/04/29 (木) 23:55:39 - 生物系院のM1です おおさん コメントありがとうございます！目的タンパクとしてAβを見ているのでGAPDHのような重めのタンパクは写りにくいという可能性に気づいておりませんでした、、、コントロールの選び方を考え直します！ 貴重なご指摘本当にありがとうございます！

(無題) 削除/引用 No.9637-7 - 2021/04/25 (日) 13:01:25 - み 決まった１レーンだけが見えないとか、インターナルコントロールがぶれるという話ですから本当にサンプル間でそのような発現量のブレや変化があるのか、テクニカルな問題なのかを区別しないといけない。 同じサンプルを１０レーン流してもブレたり１レーンだけ見えないならトランスファー以降のテクニカルな問題ですよね。シグナル出したあとCBBやポンソーで膜を染めればトランスファーの均一性が確かめれるし、トランスファー後のゲルもCBBで染めればゲルにどれだけ残っているかも見れる。 なかなか白黒つけられない人ってやっぱり工夫が足りないことが多くて、一回の実験でもデュプリケート、トリプリケートで流してレーンの位置の違いやテクニカルな誤差を上回る有意な差異を見つけないといけない。 サンプル123123 サンプル112233　と異なる流し方をしたらどうかな。

(無題) 削除/引用 No.9637-6 - 2021/04/25 (日) 07:39:02 - ぶん 細胞分裂の周期とか関係してそう その場合には、トータルプロテインみても、 結果の解釈に悩みそう

(無題) 削除/引用 No.9637-5 - 2021/04/24 (土) 23:59:35 - BCG とりあえず少し下の方にある質問9629とそのコメント群を見れ。1年近くの悩みは4分で解決する。 10年くらい前はactinのwesternをつけないで代わりにCBB染色とかで示したら、レビュアーから基本的なことができてないということでものすごい怒られた。また低酸素ストレス負荷の実験でGAPDHをローディングコントロールにしてシグナル強度補正してる偉い人もいた。でもここ2,,3年でみんなの考え方がだんだん変わってきた。ていうか落ち着いて考えたら様々な処理をするしないという時にいつでも絶対に量が不変であると保証付きの特定のタンパク質なんてそんなんもの誰にもわからないわけで、考えたらあたりまえのことに気づいただけなんだけど。雰囲気としてローディングコントロールにアクチンだのgapdhだの使う習慣は近々にフェードアウトしていくと思う。

(無題) 削除/引用 No.9637-4 - 2021/04/24 (土) 13:34:55 - medpf T/T15%ゲルというのはTris-Tricineゲルですか？ であれば、目的タンパクは低分子量タンパクでしょうから、 そのあたりのローディング、転写を見た方がいいかもしれませんね。 低分子レンジでの適切なローディングコントロールがなければ、 ウエスタンではなくCBBやamido-blackで染めても良いかもしれません。 ちなみに、メンブレンはPVDFそれともニトロセルロースでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.9637-3 - 2021/04/24 (土) 00:18:43 - ふらいむ 見えないレーンが共通しているなら ブロッティングの機械の問題では？ 同じラボの人は何か問題起きてませんか？ サンプルのロードする順番を変えて比較するか、 近所のラボに電気泳動とブロッティング装置一式を借りて、 それでも同じようにハウスキーピングがぶれるか 一度見たほうが良いと思います。

(無題) 削除/引用 No.9637-2 - 2021/04/24 (土) 00:15:20 - おお http://www.kenkyuu2.net/cgi-biotech2012/biotechforum.cgi?mode=view;Code=9629 実験の系の詳細がわからないが、アクチンとか見えなかったりするというのはちょっと問題かもしれないけど、上記の議論を読むといいと思う。 １５％なので５０kDaでも結構移りにくくなっているのは確かだと思うが、今ある情報でそれが原因と言えるわけでもないし。Transferの問題ならInternal control をしめすならヒストンなどもっと小さいものをコントロールにしたほうがいいかもしれない。

ウエスタンブロットでローディング・コントロールが見えません 削除/引用 No.9637-1 - 2021/04/23 (金) 20:21:04 - 生物系院のM1です MG6細胞内での目的タンパク質の分解をみるためにlysateを経時的に採取して、T/T15%ゲルで流して転写を行なった後、抗体に浸したメンブレンをImageQuant LASで検出しています。 目的のタンパク質はバンドがくっきり出るため増減（分解の進行）は、経時的にはっきりと定量・追跡できるのですが、GAPDHやα-Tublinといったハウスキーピング遺伝子がうまく出てくれず、1レーンだけ見えない、もしくは全体として発現量がぶれてしまうと言う現象に1年近く悩まされています。 見えないレーンは毎回共通しているのですが、手技の問題でしょうか。 もし、ハウスキーピング遺伝子で規格化を行う以外の方法でローディング量が等しいことを示したり、規格化することができる方法などあれば教えていただけると嬉しいです、、、、

全20件 ( 1 〜 20 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

このトピックにメッセージを投稿する 名前  メール  　アドレス非公開    タイトル  本文       設定  クッキーを保存（次回の入力の手間を省けます） 上に上げない（トピックの一覧で一番上に移動させません） 解決（問題が解決した際にチェックしてください） 暗証  半角英数字8-12文字の暗証番号を入れると、あとで削除、修正ができます。 送信

---

〔使い方〕 「アドレス非公開」をチェックすれば、自分のメールアドレスを公開しないで他の方からメールを受け取れます。 問題が解決した際には、解決ボタンをチェックして解決した旨のコメントをつけてください。これは、初めにトピックを作った人と管理人のみが可能です。 半角カタカナ、機種依存文字(全角ローマ数字、○の中の数字等)は文字化けの原因となりますので使わないでください。

---