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(無題) 削除/引用 No.9632-15 - 2021/04/23 (金) 17:36:17 - ｘ RIN値は？

(無題) 削除/引用 No.9632-14 - 2021/04/23 (金) 10:01:20 - s すでに指摘がありますが、結論に飛びつく前に分解かどうかを電気泳動等で直接見たほうがいいと思います。 分解で微量のmRNAが検出できないなら、ハウスキーピング遺伝子のCt値も同時に大きくなるはず。 また、普通qPCRのアンプリコンはかなり短く設定されているはずなので、一般論としてそんなに分解の影響は受けないと思う。

(無題) 削除/引用 No.9632-13 - 2021/04/22 (木) 23:21:38 - ぼぼ ありがとうございます。恐らく分解ですね。

(無題) 削除/引用 No.9632-12 - 2021/04/22 (木) 23:13:23 - おお >→私が感じているものに違いのですが、これの場合は、濃度および260/280, 260/230は正常範囲内に収まるでしょうか？ 収まります。３kbでも１００bでもRNAでその光化学的な性質は変わりません。

(無題) 削除/引用 No.9632-11 - 2021/04/22 (木) 22:31:12 - み 分解を疑うのなら泳動して確認すれば良い

(無題) 削除/引用 No.9632-10 - 2021/04/22 (木) 22:00:40 - ぼぼ 濃度および260/280, 260/230は正常範囲内です。 RT qPCRだと言うことで答えると、精製したRNAが分解されてしまっている可能性が考えられます →私が感じているものに違いのですが、これの場合は、濃度および260/280, 260/230は正常範囲内に収まるでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.9632-9 - 2021/04/22 (木) 21:59:56 - medpf その培養細胞というのは、よく知られた細胞株でしょうか？　そうであれば、あなたが調べている遺伝子がその細胞株で発現しているかどうか、過去の論文やデータベースで調べる事ができます。もし調べていないなら、確認されると良いかと思います。十分な発現が知られている遺伝子（複数）にもかかわらず、あなたのRTqPCRではかからない場合は、ハウスキーピング遺伝子がきちんとかかっているかどうか、経験豊富な方を探して、確認してもらった方が良いかと思います。 例えば、複数のハウスキーピング遺伝子でガンガンかかっているのに、他の複数の高発現（と知られている）遺伝子では全くかからないという状況であれば、RNA抽出以前の、細胞の状態（培養条件など）を確認された方が良いかと思います。

(無題) 削除/引用 No.9632-8 - 2021/04/22 (木) 20:08:40 - Ano 微量のRNAなどを扱う対策はしてますか？ たとえば、 低吸着グレードのチップやチューブ。 エタノール沈殿などでは、共沈するものの添加。 細胞にRNA抽出液を直接かける。 それから、 底面積の大きいウェル等で培養してますか？

(無題) 削除/引用 No.9632-7 - 2021/04/22 (木) 16:08:34 - おお https://www.takarabio.com/products/cdna-synthesis/purified-cdna-and-genomic-dna/tissue-specific-cdna/human-cancer-and-cell-line 出来合いのcDNAが商品として売ってますので、そういうのをポジコンにする手はありますね。

(無題) 削除/引用 No.9632-6 - 2021/04/22 (木) 13:41:37 - asan Primerの質、検出範囲などはちゃんと確認できてますか？ そのmRNAが検出レベルで発現してるという根拠はありますか？ 基本的な操作などに問題がないことは上司に確認してますか？ ハウスキーピング遺伝子以外のメジャーなものは検出できるですか？ この短いざっくりとした話だけで、あなたがあれこれ踏まえても見つからなかった回答が簡単に出るとは思えません。 しょうもないミスかもしれないし、そういうものなのかもしれないし。

(無題) 削除/引用 No.9632-5 - 2021/04/22 (木) 12:06:33 - ぽー Targetにしている遺伝子に対するPrimerの動物種はあっていますか？ 人によってはコントロール用のプライマーを種間で保存された領域で作成してヒトでもマウスでも同じものを使っていたりします。

(無題) 削除/引用 No.9632-4 - 2021/04/22 (木) 11:16:00 - おお >[Re:1] ぼぼさんは書きました : > 何が原因なんでしょうか？細胞回収時に細胞が死んでいると考えた方が良いのでしょうか？ 回収をどのようにやっているのかわかりませんので判断しかねますが、細胞をPBSなどで懸濁した状態から遠心して回収したぐらいでRT qPCRがかからないということはまずないです。 RT qPCRだと言うことで答えると、精製したRNAが分解されてしまっている可能性が考えられます。相当AbundantなHouse keeping genesは分解が進んでいてもかかったりするものですが、大抵の遺伝子はそれほどでもない量しか発現してないでしょうから、分解が進んでいたら更に検出が難しくなってきます。 RNAの分解はTotal RNAなら電気泳動やバイオアナライザーで確認できます。RNAの実験を始めたということならば最初はそういう確認をしながら、感覚を掴んでいくようにしたほうがいいです。 もう一つの可能性はPCR阻害物質の混入だけど、大抵の細胞はそんなの困ることはないと思う。メラノサイトとかはメラニンがRNAと同じ挙動を示すらしくってPCR阻害の原因になるらしいけど。 誰とは言いませんが、ある程度以上経験がある人に（直接会って）手技を教えてもらうのは一番はやい解決方法ですよ。

(無題) 削除/引用 No.9632-3 - 2021/04/22 (木) 08:52:00 - ぼぼ このような返答は不要です。 この書きぶりだと研究室に配属したばかりと思うのですが、 指導教員や先輩には質問しましたか。

(無題) 削除/引用 No.9632-2 - 2021/04/22 (木) 08:09:54 - TS この書きぶりだと研究室に配属したばかりと思うのですが、 指導教員や先輩には質問しましたか。

培養細胞のqPCR 削除/引用 No.9632-1 - 2021/04/22 (木) 07:46:48 - ぼぼ 培養細胞のqPCRを行うとハウスキーピングgeneのみ発現が見られるもののその他の遺伝子発現が検出できないことが多々あります。 何が原因なんでしょうか？細胞回収時に細胞が死んでいると考えた方が良いのでしょうか？

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