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(無題) 削除/引用 No.9629-14 - 2021/04/20 (火) 18:41:46 - fghjk blotの総タンパク質染色パタンを示すことは普通にありです。揃うはず、変わらないはず、という根拠のはっきりしない先入観から生まれたインターナルコントロールよりも説得力あります。 actinやGAPDHが揃わないとのことですが見方を変えればWTとKOで揃わないこと自体が重要な知見ではないかと思います。

(無題) 削除/引用 No.9629-13 - 2021/04/20 (火) 14:21:59 - Soshikin S様、具体的に示してくださり、ありがとうございます。 正直、驚きました。もう膜全体を染めることが一般的なものになってくるのでしょうか、、ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.9629-12 - 2021/04/20 (火) 09:30:28 - s JBCの投稿規定だと、(発現が変動しないという証拠がある場合を除いて)ハウスキーピングタンパク質は使うな、と明確に書いてあります。 http://jbcresources.asbmb.org/collecting-and-presenting-data

(無題) 削除/引用 No.9629-11 - 2021/04/20 (火) 09:10:34 - Soshikin おお先生、TS先生 お聞きして本当に良かったです。 ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.9629-10 - 2021/04/20 (火) 08:23:13 - TS PonceauSとかCBBとか、新しいテクノロジーだとStain-freeとか、Total proteinで補正するというのは特定のハウスキーピングより優れているというデータがあります。 そういうのを引用するのも妥当性を担保できるかもしれません。 https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0003269713002595?via%3Dihub 頭の固いEditorだと、b-actinのブロットんがないとかしつこく言われることもあるので、科学的根拠を示してあげるのもよいと思う。

(無題) 削除/引用 No.9629-9 - 2021/04/20 (火) 05:57:35 - おお >[Re:8] Soshikinさんは書きました : > 先生方 > もちろんリバイスのレターには具体的なハウスキーピングが揃わなかったためという理由は描いてみようかと思います。 > > ありがとうございました。 そこまで具体的に書く必要はないと思います。何なら各組織のアクチンなどの発現量をWBで見たりしたデーターを探しておいて、突っ込まれたらリファレンスに加えて、supplemental informationに加えるぐらいでいいかと思います。

(無題) 削除/引用 No.9629-8 - 2021/04/20 (火) 05:47:37 - Soshikin 先生方 思いの外こんなに早くご回答をいただけるとは思ってもみませんでした。 ありがとうございます。 はい、タンパク質定量には自信があります。 BCA法でtriplicateで行なっていますので。 他のハウスキーピングタンパク質の抗体を買ってトライエラーするよりかは、CBBで突破しようと思います。 もちろんリバイスのレターには具体的なハウスキーピングが揃わなかったためという理由は描いてみようかと思います。 ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.9629-7 - 2021/04/20 (火) 05:40:04 - Ano ジャーナルによっては、投稿ガイドに書いてある。 リバイスの投稿前に、率直に、エディターにメールで相談するという方法もあるし、 考察に書くという方法もある。 つまり、真正面から、突破。 そうすると、後々に、同じフィールドの研究者からの信頼を得られる。

(無題) 削除/引用 No.9629-6 - 2021/04/20 (火) 05:37:06 - おお RT-qPCRの場合はGAPDHなどInternal control を基準にddCtで算出するのがたいていだと思います。ただし組織間で比較する場合慎重にInternal controlを選ぶ必要があります。どれがいいかを調べた論文などありますので必要であれば検索すればいいとおもいます。 GAPDHなどのInternal control を使う理由は、サンブルごとのRTの効率などのばらつきの補正（RTの効率が一定である保証がなかったためとおもいます）だと思っています。WBの場合はこのようなステップは存在しませんのでInternal control で補正しなければいけない根拠はうすいです。 もちろんDNAからのPCRだとRT qPCRのようなバイアスもかかりませんので、Internal controlの必要はないかもしれません。RT qPCRは色々改良がくわえられたGAPDHなどInternal control が必要のないプロトコールがあるかもしれませんし、状況によっては取る必要がないかもしれませんが、細かいことは存じ上げません。

(無題) 削除/引用 No.9629-5 - 2021/04/20 (火) 04:52:56 - わお おおさん、qPCRならどう話が違ってくるのですか？ 後学のためにご教授いただけますと幸いでちゅ

(無題) 削除/引用 No.9629-4 - 2021/04/20 (火) 04:22:46 - おお ＞あくまでハウスキーピングに対する変化率でのみ比較しております。 これも議論が分かれるところだと思います。タンパク量が揃っているならアクチンなど示すにしてもアクチンを基準にせず、タンパク量ベースでシグナルを比較した方がわたしはスッキリすると思ってます。qPCRなら話が違ってきますけど。

(無題) 削除/引用 No.9629-3 - 2021/04/20 (火) 04:18:37 - おお ＞CBB染色画像を示す わたしはありだと思いますし、そういうデーターをジャッジするなら、OKとします。ただしレビューアーがどうリアクションするかは保証しませんけど（多分大丈夫とおもいますけど）。 CBB染色画像を示したうえで、補助的に色々とInternal controlをためしておいて、追求されたときはそれを示すようにしたらいいのかもしれません（違う組織で揃わない可能性をコメントとして付け加えながら）。

(無題) 削除/引用 No.9629-2 - 2021/04/20 (火) 04:01:54 - リアルタイムqPCR わりとみかけますが、考え続けた結果、気にしないことにしました。 あくまでハウスキーピングに対する変化率でのみ比較しております。

組織でのハウスキーピングタンパク質が揃いません。 削除/引用 No.9629-1 - 2021/04/20 (火) 02:31:10 - Soshikin WTとKOマウスの組織でウエスタンをしていますが、タンパク質定量はもちろんして同僚アプライしているものの、GAPDHやアクチンが結構ずれていて困っています。 使用後の膜を直接CBB染色するとレーンごとにムラはなさそうなのでハウスキーピングのタンパク質が特別揃わないのだろうと考えていますが、リバイスのための確認実験なのでGADPDHやアクチンが揃わないからCBB染色画像を示すというのもありでしょうか？

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