ECL femtoはすごく感度が高そうですね。それだけバックグランド（SN比のN）のコントロールが必要です。昔出ていたECL Advanceとかは２次抗体１０００００倍とかで、Washも５０mlぐらい使えというふうなプロトコールが示されていたと思います。ECL femtoもそれぐらい思い切ってもいいのかもしれません。
わたしも２次抗体の量はコントロールしたほうがいいと思いますし、場合によっては１次抗体の濃度も下げてもいいのではと思います。ECL Advanceは専用ブロッキング剤をうっていたので、ブロッキングも工夫する余地があるのかもしれません。わたしはたいてい１％PVPを使ってますが、それがベストかわかりません。Can Get Signal のようなものも売っているので試す価値があるのかもしれません。バッファーも少し塩濃度を上げたり。pHを高くしたりというプロトコールもあります。私は１.２xPBSをつかって。Tween ２０は０.２から０.３％です。結構いい加減に量り取っているのでだいたいこの範囲でブレるという恥ずかしい状況ではあります。
何れにせよ、しばらくコンタクトして真っ黒になるのはちょっとバックが高すぎるなと言う感覚です。
むかし、どなたか高感度のものを低感度のもので薄めて感度を調整するといった方法を教えてくれた方がいます。私はECL+グレードかそれより少し強いもの（とおもっている）で、H2O2が抜けて使えなくなったものに自前でつくったECL試薬を混ぜて感度調整しています。どれとどれのコンビネーションがいいとか言えませんが、相当強いものを使っているので、アクチンとかかえって使いづらいだろうと思いますので、低感度のものを持っていたほうがいいような気がしますので。
50 ug/laneということですが、状況によるのでなんとも言えませんが、半分ぐらいでもいいような気がします。総タンパク量が低いほうがバンドがシャープになる傾向がありますので、検出感度がある程度低くてもバンドがしっかりみえる事が多いです。
あとあまり注目しないところですが、フィルムも高感度（低分解能）と高分解能（低感度）などありますので、場合によっては後者のほうが使いやすいのかもしれません。
共同研究できたポスドクが、フィルムを２枚重ねて膜から離れた方のフィルムを使うとか、何も写ってないすでにDevelopしたフィルム（青いやつ）を間に挟むとかしていたのを見たことがあります。いい方法どうかわかりませんが。。。 |
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