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(無題) 削除/引用 No.9626-7 - 2021/04/20 (火) 18:35:24 - fghjk 尿素そのものがタンパク質分解を起こすことは考えにくいです。ただ変性状態の方がプロテアーゼに対する感受性はしばしば著しく増大しますので、精製度が十分でなくて、そこに変性剤耐性の強力なプロテアーゼが微量残存しているような場合は保存中や融解時に緩慢に分解が進む可能性は完全には否定できません。ただいろいろ悪条件が重なった場合、そういうことも時にはありうるくらいの理解でいいと思います。 プロテアーぜ以外でもペプチド結合が切れることはあり、強アルカリで加熱した時とか、OHラジカルのような活性酸素に晒した時です。強酸でも高温に長く晒すと切れることがあります。いずれもかなり極端なことをした場合です。

(無題) 削除/引用 No.9626-6 - 2021/04/20 (火) 17:18:16 - うらこ >[Re:5] おおさんは書きました : > 尿素の変性作用が過剰ってどういう状態をイメージしているのですか？ペプチド結合などが切れたりするのは変性（生化学的なタンパク質の変性の定義において）の域を超えています。 強アルカリの長期間処理はタンパク質を切断してしまうと聞いていたので、全く科学的に基づいてはいないのですが変性剤も過剰に長期間な場合はそんなこともあるのかなぁと思いまして。すいません。

(無題) 削除/引用 No.9626-5 - 2021/04/20 (火) 16:05:02 - おお 尿素の変性作用が過剰ってどういう状態をイメージしているのですか？ペプチド結合などが切れたりするのは変性（生化学的なタンパク質の変性の定義において）の域を超えています。

(無題) 削除/引用 No.9626-4 - 2021/04/20 (火) 12:07:38 - うらこ おおさま、U1さま ありがとうございます。 Carbamylationには気を付けたほうがよさそうですが、尿素の変性作用が過剰になるということはなさそうですね。 とりあえず、尿素保存で試してみよと思います。

(無題) 削除/引用 No.9626-3 - 2021/04/20 (火) 08:32:04 - U1 私の経験的には尿素保存で全く問題ないと思います。 質量分析を行ったこともありましたが、carbamylationは 検出できなかったと記憶しています。 コツとしては、サンプルを常に15-30℃の範囲におくのが重要だと教わりました。 15℃を下回れば尿素が析出して変性効果が弱まり、30℃を超えるとcarbamylationが起こりやすくなるから、といった具合です。 凍結保存するときは液体窒素で一気に凍結し、 解凍するときは手で温めて溶かすようにしています。

(無題) 削除/引用 No.9626-2 - 2021/04/19 (月) 02:11:01 - おお https://info.gbiosciences.com/blog/preventing-carbamylation-when-using-urea-as-a-protein-solubilization-buffer Carbamylationが気になります。ただ大抵のCarbamylationをみる実験は比較的温度が高い状況でなされています。 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4072244/ ammonium containing buffersでCarbamylationが抑えられるという報告がありますね。 私は、そういう懸念があるのでグアニジンを使うか、置換してから保存してます。

精製タンパク質を変性剤中で保存 削除/引用 No.9626-1 - 2021/04/18 (日) 19:02:33 - うらこ 蛋白質の精製を行っております。 ラボに他に精製に詳しい人がおらず、どなたか教えてください。 凝集性の高いタンパク質であるため、大腸菌から封入体として回収し、５−８M尿素によって変性させながら、Hisタグ精製する予定です。 尿素を抜くとすぐに凝集体化してしまうと思われるため、尿素を抜いてHisタグ精製するよりも、尿素存在下でイミダゾールと一緒に精製して、そのまま-80度で保存しようと思っております。（使用する直前に尿素を抜いて、目的の他のタンパク質と一緒に混ぜて使う予定です） 質問は、精製タンパク質は尿素と一緒に長期間保存するとタンパク質のペプチド結合などが切れてボロボロになってしまうものでしょうか？ もしくは尿素に長期間保存しても問題はないものでしょうか？

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