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冷アルコールによる細胞固定にるいて トピック削除
No.9620-TOPIC - 2021/04/15 (木) 18:15:05 - kanade
細胞免疫染色をしています。
４％PFAで染色がうまくいかず、冷エタノール固定を試すこととなりました。
アルコール固定については、理論を理解でいたのですが、なぜ冷たいアルコールを使用するのかが、理由がわかりません。
どなたか教えていただけませんでしょうか。
冷エタノール固定は−20℃でオーバーナイトするように先生に言われました。
　
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No.9620-6 - 2021/04/16 (金) 18:20:36 - kanade
教えていただきありがとうございます。

４％PFA,Triton１％でやってみて、そのほかは検討せずにエタノール固定になりました。
今日結果が出たのですが、染色はうまくいきました。

脱水による収縮に伴う構造変化を最小限に抑えることが私も大切tだと考えていたため、なぜこうなったのかはよくわからないのですが、また、PFAやTritonの検討も行いたいと思います。

(無題) 削除/引用
No.9620-5 - 2021/04/16 (金) 07:09:11 - Ano
そもそもの状況が気になります。

4％PFAを何分使うかとか、
Tritonは10%液ぐらいを作ってから、様々な濃度や時間で
検討するとかしてますか？

組織切片とは、全く違うので。

抗体の多くは、アルコール固定については、検討していないと思うので、
使わない方が良いと思っています。

(無題) 削除/引用
No.9620-4 - 2021/04/16 (金) 01:50:30 - q４う
有機溶媒による固定は一般的には冷温の方が固定効果が高いと言われます。誘電率の低下と温度の関係とかそういうのです。細胞や切片ならば固定時間は数分~10分以内の範囲で行われますし、それで十分です。PFA固定と比べて、抗原性の維持にすぐれていると言われますが、それでも抗原によっては流出したり、細胞内の構造が変化したりすることがあると本で読んだことがあります。-20℃、O/Nは極端に長すぎで、不必要というかあまり良いことはない様な気がします。有機溶媒固定では、脱水による収縮に伴う構造変化を最小限に抑えることが重要ですし。大型の臓器そのままとかを固定するときと混同しているのかなあと推察します。自分で検討して最適条件を設定しましょう。

(無題) 削除/引用
No.9620-3 - 2021/04/15 (木) 21:30:28 - kaede
教えていただきありがとうございます！

わかりやすく教えていただき助かります。
温度が低いと、エタノールの作用がゆっくりになるとの理解でよろしいでしょうか？

私も長いなぁと思ってるのですが、先生曰くそれでうまくいってるとのことでした。２４時間以上であればいくらでも良いとも。
長ければ長いほど、染色に悪影響ないのか心配ではありますが。。。

(無題) 削除/引用
No.9620-2 - 2021/04/15 (木) 18:31:08 - G25
アルコールを冷やす意味は、場面によって異なるところがあるかもしれませんが、

アルコールを氷点下に冷やすことで、形態を損ねる急激な脱水を防ぎ、穏やかにアルコール置換されるということが挙げられます。
組織中の水が凍った状態から徐々にアルコールに置換されているイメージ。

>冷エタノール固定は−20℃でオーバーナイトするように先生に言われました。
　

固定時間は、ものによると思いますけど。浸透しにくいものは当然時間がかかる。
しかし、細胞標本でオーバーナイトは、ずいぶん長い設定だなあと思います。浸透性は高いはずなので、固定自体はもっと短時間で完了すると思います。
固定以外の効果（脱脂、浸透性の向上など）をねらっているのかしら。

冷アルコールによる細胞固定にるいて 削除/引用
No.9620-1 - 2021/04/15 (木) 18:15:05 - kanade
細胞免疫染色をしています。
４％PFAで染色がうまくいかず、冷エタノール固定を試すこととなりました。
アルコール固定については、理論を理解でいたのですが、なぜ冷たいアルコールを使用するのかが、理由がわかりません。
どなたか教えていただけませんでしょうか。
冷エタノール固定は−20℃でオーバーナイトするように先生に言われました。
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