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(無題) 削除/引用 No.961-16 - 2012/09/30 (日) 05:30:41 - おお そうですね。機会があればためしてみようかと思います。でもしらない方法はunexpectedなトラブルもあるかもしれませんので、またここでお世話になるかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.961-15 - 2012/09/29 (土) 18:01:48 - conc どうしても気になるならば、BCA以外の定量法はいかがでしょうか。 例えば、Pierce 660 nm Protein Assay、RC DCプロテインアッセイキット、EZQ Protein Quantitation Kit、SYPRO RUBY blot stain、Deep Purple Total Protein Stainなど予算が許せばいろいろ方法はあると思います。

(無題) 削除/引用 No.961-14 - 2012/09/28 (金) 02:00:56 - おお >[Re:13] taさんは書きました : > 許容限界濃度の定義って難しいですよね。 > 例えばPierceだとSample to WR ratio = 1:20の時に許容される濃度ってなってて、プレートリーダ用のプロトコルだともっと低いはずって書いてありますよね。 そうですね。最終的には反応溶液中の濃度で判断しないといけません。と思っていながらあまり深く考えてなかったりします。。。 > また、許容の定義も（多分）substance無しの0.9% salineで標準曲線を準備した時に、substance有りのサンプルで10%以上タンパク濃度見積もりがずれない範囲とされているみたいです。 結局は自分の実験で許容範囲かどうか確かめた方がいいのかもしれませんね。 > とすると、おお様のようにサンプルと同じバッファーで標準曲線を準備した場合には、許容限界濃度はもっと高くなっていると考えてもいいんじゃないでしょうか。 上限は確実にさがっているでしょう。私もそういう気がします。 > サンプル濃度が低いものについての心配については、バッファーが存在していようと、してなかろうと、バックグランドとの差が小さいというのは同じで、 バックグランドの10%の値で測定誤差などを考えた時のエラーと、バックグランドなしで同じdeltaODの時での誤差を心配しています。

(無題) 削除/引用 No.961-13 - 2012/09/28 (金) 01:05:43 - ta 英語が苦手なんで、読み取り間違えてるかもしれないですが。 許容限界濃度の定義って難しいですよね。 例えばPierceだとSample to WR ratio = 1:20の時に許容される濃度ってなってて、プレートリーダ用のプロトコルだともっと低いはずって書いてありますよね。 また、許容の定義も（多分）substance無しの0.9% salineで標準曲線を準備した時に、substance有りのサンプルで10%以上タンパク濃度見積もりがずれない範囲とされているみたいです。とすると、おお様のようにサンプルと同じバッファーで標準曲線を準備した場合には、許容限界濃度はもっと高くなっていると考えてもいいんじゃないでしょうか。 サンプル濃度が低いものについての心配については、バッファーが存在していようと、してなかろうと、バックグランドとの差が小さいというのは同じで、少し別の問題になってくるように思います。定量したいサンプルと同程度の濃度で、しっかりした（ポイントを多くとった）標準曲線を準備することが役に立つのではないかと個人的には感じます。

(無題) 削除/引用 No.961-12 - 2012/09/27 (木) 22:57:09 - おお ああそういうふうには考えていませんでした。コメントありがとうございます.

(無題) 削除/引用 No.961-11 - 2012/09/27 (木) 15:59:25 - ~ リンク先も今回も、グリセロールが許容濃度範囲の上限いっぱいという話ですよね。 たまたまかもしれませんが、エタノール、DMSO、アセトン等の有機溶媒も10%までですので、 水の濃度が90%よりも低くなることが影響しているのでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.961-10 - 2012/09/27 (木) 02:46:32 - おお BCAは酸化還元反応であることは承知してましたので、還元剤などはバッファーには入れておりませんが、、、 一部還元糖なども反応しますよね、たしか、、、

過去にもグリセリンが出てます 削除/引用 No.961-9 - 2012/09/26 (水) 22:56:48 - ゲッツ http://www.kenkyuu2.net/cgi-biotech2011/biotechforum.cgi?mode=view;Code=1257 結局グリセリンが怪しいと言うことで終わっていますが・・・ 還元性物質の混入でもあるのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.961-8 - 2012/09/26 (水) 08:43:19 - おお みなさんありがとうございました。グリセロールかSDSを疑うのがあとでみてみると自然かなあと感じました。コンビネーションで起こるとしたらまたそれはやっかいですね。

(無題) 削除/引用 No.961-7 - 2012/09/25 (火) 15:19:10 - おお >[Re:6] taさんは書きました : > 組み合わせとかも考えると、それぞれを調べていくのはたしかに面倒臭そうですね。 > ところで、下駄を履いているとはどういうことでしょうか？例えば、バッファーをバックグランドとして引き算、とか、標準曲線用のサンプルにほぼ同量のバッファーを入れて計測、とかはしないのですか？ スタンダードもサンプルと同じバッファーで用意してますし、ねんのためバッファーもいれないブランクをバッファーだけの濃度０のスタンダードとは別に置いてます。なので気がついたのですが、検量線はほぼ直線でかけるし定量には邪魔になってないのですが、まあちょっとサンプルの濃度が低くなってきたら誤差が増えるかもしれないなァとおもって、そういうサンプルを図る必要性が出てくる前にすこし情報を集めておこうと思った次第です。

(無題) 削除/引用 No.961-6 - 2012/09/25 (火) 15:09:58 - ta 組み合わせとかも考えると、それぞれを調べていくのはたしかに面倒臭そうですね。 ところで、下駄を履いているとはどういうことでしょうか？例えば、バッファーをバックグランドとして引き算、とか、標準曲線用のサンプルにほぼ同量のバッファーを入れて計測、とかはしないのですか？

(無題) 削除/引用 No.961-5 - 2012/09/25 (火) 11:55:29 - ~ キットによって違うのかもしれませんが、 http://datasheets.scbt.com/sc-202389.pdf を見ると、許容限界の濃度ぎりぎりなのはグリセロールだけですね。

(無題) 削除/引用 No.961-4 - 2012/09/25 (火) 10:33:24 - グリセロール 10％グリセロールってBCA法のギリギリな気がします。 同じような組成のタンパク溶液を測定するときは、 水で10倍希釈してから測定するとほとんど影響うけません。

(無題) 削除/引用 No.961-3 - 2012/09/25 (火) 10:07:06 - おお >[Re:2] 774さんは書きました : > 直感的にはSDSな気がしますが、 > それぞれ単独溶液で測定してみてはいかがでしょうか？ ありがとうございます。余裕がある時にやってみますって思っていながらやってないんですよねぇ。。。

(無題) 削除/引用 No.961-2 - 2012/09/25 (火) 10:01:47 - 774 直感的にはSDSな気がしますが、 それぞれ単独溶液で測定してみてはいかがでしょうか？

BCA 削除/引用 No.961-1 - 2012/09/25 (火) 09:51:55 - おお タンパク定量ですが、BCAをつかってます。グリセロール 10%、SDS 1〜2%、TRIS 20mM、NaCl 150mMぐらい、若干のKClが入ったバッファーで定量しています。はかれていますが、バッファーだけで発色がある程度見られ全体的に下駄をはいている感じがします。上記の組成のなにが影響していると思いますでしょうか?

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