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(無題) 削除/引用 No.960-19 - 2012/09/30 (日) 05:43:17 - おお >[Re:17] さんかさんは書きました : > >1次抗体、2次抗体の希釈率ともに1:1,000 > 抗体の濃度が同じってことは、二次抗体によるシグナルの増強効果無しってことでしょうか？ 一次抗体を洗ってから2次抗体を加える時は１次抗体は目的のサンプルに結合しているもの以外は洗い流されてしまってますので、2次抗体は大過剰いれていることになります。 １次抗体と2次抗体を同時に入れるということは、すべての1次抗体が2次抗体が認識されていないとシグナルの効率は落ちるはずです。なので心理的には1次抗体をできるだけ下げて2次抗体を増やしたいところですが、、、 すべての１次抗体をラベルと言うのはむりがありますが、インターなるコントロールくらいはラベルされたものかってもいいかなっていうのはたしかにありますね。

(無題) 削除/引用 No.960-18 - 2012/09/30 (日) 05:34:48 - おお >[Re:16] Miamiさんは書きました : > GAPDHやbea-actinなら問題なくいけると思います。 > あと某社の1次抗体 成功れいはあると言う事でencouragingなコメントありがとうございました

(無題) 削除/引用 No.960-17 - 2012/09/30 (日) 01:09:34 - さんか >1次抗体、2次抗体の希釈率ともに1:1,000 抗体の濃度が同じってことは、二次抗体によるシグナルの増強効果無しってことでしょうか？ストックの濃度は別かなぁ。二次抗体によるシグナルの増強効果無しなら、HRP conjugateとかを購入しても同じでしょうか？モノクローナルになるから更にシグナルが下がるし、コストが変わってくるかなぁ。難しそうですね。

(無題) 削除/引用 No.960-16 - 2012/09/29 (土) 12:59:55 - Miami GAPDHやbea-actinなら問題なくいけると思います。以前1次抗体、2次抗体の希釈率ともに1:1,000、インキュベートは室温1時間でやって両者とも問題なくできました。もちろん1次抗体の性能にもよるとは思いますし、全ての抗体で試しているわけではないので、軽々しくすすめるわけではありませんが。 あと某社の1次抗体(某転写因子を認識するポリクローナル抗体ですが、beta-actinなみにきれいにバンドがでます)でもうまくいったので、1次抗体の性能がよくて、その抗体を使ったウェスタンを何回も繰り返すことが分かっている場合にはあれこれ考える前に一度ためしてみてもいいのでは。

(無題) 削除/引用 No.960-13 - 2012/09/29 (土) 11:18:59 - ~ フローサイトかなにかで、あらかじめ二次抗体と反応させた一次抗体を使って標識する方法があったような気がします。 自分はやったことがないので今ひとつ詳細がわかりませんが。。。

(無題) 削除/引用 No.960-12 - 2012/09/25 (火) 09:04:55 - おお ががさんが懸念を明示してくださいましたが、妥協するところもあるけどできないことはないという感じでしょうか。そういえばGFPモノクロと、他のモノクロを違うメンブレンで同時にウエスタンしていて、一次抗体のあとあらって、2次抗体を同じ2つのメンブレンをおなじ容器で処理したらGFPでないほうのメンプレンにもGFPシグナルが検出されたことがあるなぁ。

(無題) 削除/引用 No.960-11 - 2012/09/25 (火) 08:55:36 - ~ 抗ベータアクチン抗体を一次抗体とした後で使用した二次抗体を再利用すると、 一次抗体なしでもベータアクチンが検出されていました。 結果として、一次抗体-二次抗体の複合体ができていたのだと思います。 一次抗体と二次抗体の濃度と濃度比、検出対象のエピトープ量あたりがパラメーターになるのでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.960-10 - 2012/09/25 (火) 07:50:33 - おお >[Re:9] ががさんは書きました : > ”2次抗体の一次抗体への結合部位”と表現するのは分かりにくいですね。すみません。 > 一次抗体のいろんな部位に二次抗体が結合する（二次抗体はポリクロなんで）と考えます。 >[Re:8] ががさんは書きました : > 2次抗体の一次抗体への結合部位は一カ所ではないでしょう。 > １次抗体の数カ所に二次抗体がくっつき、そのくっついた二次抗体のもう片方の結合部位には別の１次抗体がくっつき、、、、、、、、、、 > どうなっちまうんだ。。。 まさにそれを想像していました。ありがとうございました。 最近はモノクロの2次抗体も出回っているようですね。それなら回避ができますね。

(無題) 削除/引用 No.960-9 - 2012/09/25 (火) 06:50:13 - がが ”2次抗体の一次抗体への結合部位”と表現するのは分かりにくいですね。すみません。 一次抗体のいろんな部位に二次抗体が結合する（二次抗体はポリクロなんで）と考えます。

(無題) 削除/引用 No.960-8 - 2012/09/25 (火) 06:47:08 - がが 2次抗体の一次抗体への結合部位は一カ所ではないでしょう。 １次抗体の数カ所に二次抗体がくっつき、そのくっついた二次抗体のもう片方の結合部位には別の１次抗体がくっつき、、、、、、、、、、 どうなっちまうんだ。。。

(無題) 削除/引用 No.960-7 - 2012/09/25 (火) 06:34:28 - おお >[Re:4] ががさんは書きました : > 抗体ってY字になっていて二カ所結合サイトがありますよね。 > 一次と二次を一緒に入れると、抗体ー抗体の巨大な複合体ができちゃいますよね。 ありがとうございます。 つまり、凝縮して沈殿してしまう可能性があるということでしょうか? 2次がモノクロであれば3つの抗体のコンプレックスになりますよね。

(無題) 削除/引用 No.960-6 - 2012/09/25 (火) 06:02:53 - ab 時間ない時とか試してみようと思った事もありますが、やってる人もいるみたいですね http://bitesizebio.com/articles/streamline-your-western-blots/

(無題) 削除/引用 No.960-5 - 2012/09/25 (火) 06:02:23 - もう少し もう少し早く気づけば、商売が出来たかもしれませんね。 例えばこのあたりでしょうか。 http://www.genoprice.com/onestep.htm

(無題) 削除/引用 No.960-4 - 2012/09/25 (火) 05:58:22 - がが 抗体ってY字になっていて二カ所結合サイトがありますよね。 一次と二次を一緒に入れると、抗体ー抗体の巨大な複合体ができちゃいますよね。

(無題) 削除/引用 No.960-3 - 2012/09/25 (火) 05:40:56 - おお ん、一次抗体にたいしての、2次抗体のりょうが問題になるかな。

(無題) 削除/引用 No.960-2 - 2012/09/25 (火) 04:53:41 - おお >ウエスタンの1次、2次 抗体のことです。

ウエスタンの1次、2次を一緒にインキュベート 削除/引用 No.960-1 - 2012/09/25 (火) 04:51:57 - おお ウエスタンの1次、2次を一緒にインキュベートすると1スッテップですむのですが、何かそういうプロトコールや、議論、実験結果と考察など見たことがありますか?

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