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(無題) 削除/引用 No.9577-11 - 2021/03/15 (月) 11:07:02 - 774 私なら明らかにミスった自覚のあるサンプルを実験には供しません。 何か通常とは異なる/予想外の結果が出たときに同じミスを再現してやり直せるか?ということになるから。 再現できたとして意味のある結果であるかも考えなければならないし。 勿論そこから世紀の大発見が生まれる可能性がゼロではないのは歴史が示す通りですが、元の予定していた実験には使いませんね。 > ややこしいですが、その過程はまぁどうでもよく、何が言いたかったかというと 本人がこう言う位の内容は要らない気がしますね。 どうでもいいなら書くな読ますなと思うこともあるでしょう。 タイトルと > このネバネバになった細胞懸濁液は、もう捨てるしかないでしょうか？ をまず書いて、それから経緯の要点を書けばいい。 要点を1に書いて、詳細を2に書くとか。 見出しがなく、普通サプリメントに入れるようなものまで全部載ってる論文はかえって読みづらいでしょう。同じことです。

(無題) 削除/引用 No.9577-10 - 2021/03/15 (月) 09:13:39 - ど素人 個人的な意見ですが、PBS様の投稿文はそれほど分かりにくくないと思います。 もし元の投稿文に改善点があるとすると、本人の疑問点が文章の終盤まで表れない点であり、これは冒頭に問題点をまず提示することで改善すると思います。それに加えて、タイトルで問題点が分かればなお良いと思います。 また、短文で充分という意見に関しては、私も実験条件が分かるかどうかが重要だと思います。ですから、自ら行った手順の説明は意味があると思います。ただ、それは要らないという人にとっては、論点がタイトルと冒頭で示されていれば以下はスキップ可能です。

(無題) 削除/引用 No.9577-9 - 2021/03/15 (月) 06:23:30 - Wash >それと老婆心ですが、出題文は「間違えて10xPBS でウォッシュしてネバネバになった細胞からトータル RNA が回収できるか」この１行で十二分です。日記みたいな冗長な質問は読む気が失せます（回答者が減ると思います）。 逆に「もっと細かく説明しろ」「なぜそんなことをしたのか過程まで書かないとわからない」というコメントを出す人もいる（この掲示板でもいます）から、この点は一概には言えないように思います。全ての作業は氷上でやったのか？などの情報があれば、つけられるコメントが変わる場合もあります。簡潔すぎるよりかは、なんとか出来る限りの情報を提供しようとするコメント主の方が私は好きです。

(無題) 削除/引用 No.9577-8 - 2021/03/15 (月) 02:08:48 - おお まあ国語の問題なんですけど、これは書いたりプロポーズをこなしたりして伸ばしていくしかないです。私もわけのわからない日本語をよく書いてきましたし。すぐにできる人は何書いてるんだって思うでしょうけど。 現状のスキルはともかく、論点をわかりやすく書くというのは意識してほしいですね。

(無題) 削除/引用 No.9577-7 - 2021/03/14 (日) 13:30:30 - 、、、 細胞が高張液（5xPBS）で破砕された瞬間細胞外の RNase で分解されていますので使えません。それと老婆心ですが、出題文は「間違えて10xPBS でウォッシュしてネバネバになった細胞からトータル RNA が回収できるか」この１行で十二分です。日記みたいな冗長な質問は読む気が失せます（回答者が減ると思います）。

(無題) 削除/引用 No.9577-6 - 2021/03/14 (日) 05:12:19 - おお >[Re:5] PBSさんは書きました : > おおさん、繰り返しありがとうございます。 > > ニードルは妙案ですね。26Gとか、その辺の細い径の針でやれば、うまくほぐれてくれそうです（でも、細すぎると詰まっちゃいますかね？）。 > ２６Gでもいいかと思います。ただ細いと確かに吸いづらいとかで戸惑ったり、場合によってはシリンジを押すとニードルが飛んでいったりとあまりうまくいきません。個人的には細胞からのRNA抽出で２３から２５Gを使うことがおおいです。最近はTrizolの量を上げてニードルを使うのをなるだけ避けてはいますけど。 超音波でもいいでしょうけどDNAをずたずたにするような出力だとちょっとまずいような気がしますので加減が難しいかもしれません。 GEのRNA抽出カラムのキットには組織とかでLysisする際のデブリを除くための遠心用フィルターがついています。どろどろのLysatesもこれを通すと解消されます。材質がわからないのと、単独で売っているのかもわからないのでTrizolでやるときはどうしようもないのですが。

(無題) 削除/引用 No.9577-5 - 2021/03/14 (日) 04:05:16 - PBS おおさん、繰り返しありがとうございます。 ニードルは妙案ですね。26Gとか、その辺の細い径の針でやれば、うまくほぐれてくれそうです（でも、細すぎると詰まっちゃいますかね？）。 概ね流れは問題ないということで、試行錯誤しながらやってみようと思います。 ご助言、どうもありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.9577-4 - 2021/03/13 (土) 17:39:15 - おお 核のRNAを回収するのであればお示しのような核単離をすればいいと思います。バッファーにRNase inhibitorを加えたりしてもいいかもしれませんが、なくても出際よくやればそう問題にはならないでしょう。 回収した核はTrizolでもいいです。ただしねんちょう（どろどろ）になってうまく溶液中に均一に分散しにくいのは事実です。ニードルにシリンジで通したり、何らかの工夫が必要かもしれません（ポリトロンでもうまくいくだろうか）。TrizolのVolumeも多めでやれば回収しやすいでしょう。

(無題) 削除/引用 No.9577-3 - 2021/03/13 (土) 17:19:20 - PBS おおさん、どうもありがとうございます。 大変説得力あるご説明で、諦める方向で納得しました。 実は大目的としては、核分画からRNAをビオチン化オリゴを用いて精製したいんですけど（＝多少混ざっていても問題ないので、細胞質分画を除いて、よりキレイな核分画を用いたい。トータルRNAを用いた場合、回収率があまりにも悪かったので、一段階ステップを増やしている次第です）、適当に拾ってきたこのプロトコールを実施した後、核ペレットをTrizol精製に持っていっているのですが、核ペレットがTrizolにうまく懸濁されないなど、イマイチな印象を抱いています。 周りに相談できる人がいないため、自力で手探りでやっているのですが、何かもっといい案がある方いらっしゃいましたら、アドバイスいただけると改めて大変ありがたく存じます。

(無題) 削除/引用 No.9577-2 - 2021/03/13 (土) 16:55:15 - おお わたしは諦めます。 ネバネバになったということはすでに細胞は壊れて、高塩濃度によりクロマチンがDNAからはがれDNAが放出されたような状態。 RNAを抽出するのなら、細胞内のRNaseなども不活化してしまわないと分解が進むので、Intactな細胞からいきなりKitなどのLysis Bufferを使ったほうがいい（普通は強力なタンパク変性剤が入っている）。

1XPBSではなく、高濃度のPBSで細胞をウォッシュしてしまった 削除/引用 No.9577-1 - 2021/03/13 (土) 16:36:11 - PBS とあるヒト培養細胞の核分画を回収するために、以下のプロトコールを実施するつもりでした。 thermofisher.com/us/en/home/references/protocols/cell-and-tissue-analysis/elisa-protocol/elisa-sample-preparation-protocols/nuclear-extraction-method-.html 最初のPBSでの洗いは、クリーンベンチ内で行ったためいつも使っている1XPBSで問題なかったのですが、それ以降のステップでは、普通のベンチで行うため、別の冷蔵庫に入っていたPBSボトルを使おうと思ったのですが、それが微妙に足りなかったため、普段使いの正しい1XPBSストックをそのボトルにクリーンベンチ内で継ぎ足して、外で使う用のものを作製しました。 （ややこしいですが、その過程はまぁどうでもよく、何が言いたかったかというと、別の冷蔵庫にあったのは実は10XPBSのボトルで、遥かに高濃度のPBSを作って使ってしまった、ということです。継ぎ足した量は半々ぐらいだったと思うので、５Xとか6X濃度だと思われます。） なぜミスに気付いたかというと、沈殿後1回目のPBSのウォッシュで、普段はスムーズにウォッシュができるのに、今回は明らかにいつもと勝手が違い、まるで溶菌が起こったかのように、細胞がネバネバになってしまったためです。 このネバネバになった細胞懸濁液は、もう捨てるしかないでしょうか？ 最悪トータルRNAさえ取れれば使い手があるので、全く無駄にはならないのですが、もうまるで意味が分からない状況ですし、諦める他ないですかね…？ 結構な量の細胞だったのに、無念です…。 「私ならこうする」というアイディアがある方いらっしゃいましたら、ご教示いただけると助かります。 よろしくお願いします。

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