全9件 ( 1 〜 9 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

(無題) 削除/引用 No.9570-9 - 2021/03/23 (火) 16:46:39 - wwn InFusionはたしかに高いですね。 そこでiVEC3はいかがでしょう。 こちらではコンピテントセルでうまくうごいていますよ。 https://shigen.nig.ac.jp/ecoli/strain/

(無題) 削除/引用 No.9570-8 - 2021/03/11 (木) 16:38:06 - G25 >Fermentasの資料で+3 ntでも危うい酵素と言ったら、あまりメジャーなものはなくて、 見落としていたけれど、Sph1はクローニングサイトにあるメジャーなやつだけど、+++には最低+5 ntになってますね。

(無題) 削除/引用 No.9570-7 - 2021/03/11 (木) 15:37:36 - G25 >Thermo Fisherに吸収される前のFermentasが独自に出していた資料ではそのようになっています。 あんな有用な情報、吸収合併のどさくさにまぎれて闇に葬られていいはずないと思って探してみました。どこかのホームページからリンクをたどることもできず、直リンしないとたどり着けないような奥まったところにひっそりと眠っておりました。 https://static.fishersci.com/cmsassets/downloads/segment/Scientific/pdf/Chemicals/cleavage_efficiency.pdf いつ抹殺されるかもわからないので、ご興味のあるかたはお早めにDLを。 >例えばNEBの資料ではEcoR1は+3 ntで+++ (50-100% cut)、 見直してみたら、+5 ntで+++でした。+3~4 ntでは++ですって。 いっそう低く見積もりすぎじゃないかなあ。

(無題) 削除/引用 No.9570-6 - 2021/03/10 (水) 18:26:17 - 無名 余談ですが、 in fusionは高いですが、京都産業大学の本橋先生のSLiCEなら自作できますし、私はやったことはないですが、Aqua cloningってのもあります。 http://www.cc.kyoto-su.ac.jp/~motohas/motohashi_lab/oyakudachi_others_SLiCE.html https://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0137652

(無題) 削除/引用 No.9570-5 - 2021/03/10 (水) 17:10:38 - G25 PCR産物をプライマー上の制限酵素サイトで切断するのは、実際、効率が良くないことが多い。それは足場の問題というより、PCR産物が端から端まできれいなduplexになっていないせいなんじゃないかと最近思っている。結論を言うと、PCR産物を消化する必要があるときは、サイクル数が過剰にならないように、少なめにしたほうがいい。 PCRのサイクルが過剰になってくると、一本鎖を鋳型にして新しい鎖が合成させれて二重鎖になるより、相補な一本鎖同士が再対合、つまりアニールする頻度が上がってくる。このとき、端から端まできれいに対合するとは限らない。ファスナーでも途中に噛み合わないで飛ばした歯があると、前後の閉じ合わさったところも歪みが来る。同じようにDNA二重鎖もregistoryがおかしくなることがある。そうなると制限酵素は、認識部位を正しく認識し、切断することができなくなる。 実際、サイクル数が少なめのときは泳動バンドがシェープでも、サイクル過剰になってくると、オーバーロードしないように電気泳動しても、バンドがボケてくる。ちょっと産物がヘテロジナスになっている感じ。

(無題) 削除/引用 No.9570-4 - 2021/03/10 (水) 16:54:28 - G25 Fermentasの資料に基づき、メジャーな酵素で3 nt余剰にして切れないものはないと思っています。 今、閲覧できるのはNEBの資料しかなくなってしまいましたが、Thermo Fisherに吸収される前のFermentasが独自に出していた資料ではそのようになっています。 例えばNEBの資料ではEcoR1は+3 ntで+++ (50-100% cut)、Not1は+5 ntでも++ (20-50% cutですが、Fermentasの資料ではそれぞれ+1 nt、+2 ntで+++です。Fermentasの資料で+3 ntでも危うい酵素と言ったら、あまりメジャーなものはなくて、一度でもラボで現物を見たことがあるのでもAat2, Nhe1, Pae1, Taq1くらいなもの。 なぜ両社で違うのか、それはアッセイ方法も違いだと思います。 F社は末端RI標識したプライマーで実際にPCRをかけた産物を消化、泳動して放射線イメージングで評価しています。 それに対して、N社は末端蛍光標識したオリゴDNAをアニールさせたものを基質にして蛍光イメージングで評価しています。蛍光団による障害や基質DNAの鎖長の短さからくる酵素のアクセスの頻度の減少とか、アニールで作ったDNAが100%完全な二重鎖になっていないとかで、切断効率を低く見積もっている可能性があるのではと考えます。

(無題) 削除/引用 No.9570-3 - 2021/03/10 (水) 11:33:31 - おお https://www.neb.com/tools-and-resources/usage-guidelines/cleavage-close-to-the-end-of-dna-fragments ３塩基ぐらい延長すると多くの酵素が使えるようになると思うけど、それでも切りにくい酵素はある。NotIとか３塩基でも切りにくかったりするらしい。

(無題) 削除/引用 No.9570-2 - 2021/03/10 (水) 11:26:26 - s https://international.neb.com/tools-and-resources/usage-guidelines/cleavage-close-to-the-end-of-dna-fragments

ライゲーション用のインサート用意 削除/引用 No.9570-1 - 2021/03/10 (水) 11:16:29 - ライゲーション ライゲーションのインサートにPCR産物を使いたいので、プライマーの5'側に制限酵素サイト配列をつけて、それで作ったPCR産物の二本鎖フラグメントを制限酵素で切ってベクターと同じ突出末端を作ってライゲーションしたいのですが、プライマーの制限酵素配列のさらに5'側って何bpくらい余分な配列（酵素の足場）をつけないと、うまく切れないのでしょうか？ TAKARAのIn-Fusionを使えばいいのですが、ちょっと高いのでそんなに使いたくないです。

全9件 ( 1 〜 9 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

このトピックにメッセージを投稿する 名前  メール  　アドレス非公開    タイトル  本文       設定  クッキーを保存（次回の入力の手間を省けます） 上に上げない（トピックの一覧で一番上に移動させません） 解決（問題が解決した際にチェックしてください） 暗証  半角英数字8-12文字の暗証番号を入れると、あとで削除、修正ができます。 送信

---

〔使い方〕 「アドレス非公開」をチェックすれば、自分のメールアドレスを公開しないで他の方からメールを受け取れます。 問題が解決した際には、解決ボタンをチェックして解決した旨のコメントをつけてください。これは、初めにトピックを作った人と管理人のみが可能です。 半角カタカナ、機種依存文字(全角ローマ数字、○の中の数字等)は文字化けの原因となりますので使わないでください。

---