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コメントありがとうございました。 削除/引用 No.9555-8 - 2021/03/19 (金) 16:51:59 - だるまさん しばらく掲示板チェックしていなくてすみません。 >[Re:7] c fghjkl：・さんは書きました : > 前半の反応速度（傾き）と一旦止まった後で再開してからの反応速度（傾き）は同じ感じですか。 いいえ、違います。再開してからの方が傾きが大きいです。でもしばらくするとまた元の傾きに戻ります。 > その酵素は４次構造（サブユニット構造）をとりますか。 ある昆虫由来の酵素（組換型）で、これ自体は新規に見つけたものですが、既知のエステラーゼと70%程度の相同性があります。実際今回の解析も代表的なエステラーゼ基質を使ったアッセイ系であり、活性が認められます。これまでにサブユニット構造をとるといった報告はありませんが、今回解析した酵素ではもしかすると取るのかもしれません。この傾きの変化はサブユニット構造を連想させますか？

(無題) 削除/引用 No.9555-7 - 2021/03/05 (金) 16:54:42 - c fghjkl：・ 前半の反応速度（傾き）と一旦止まった後で再開してからの反応速度（傾き）は同じ感じですか。 その酵素は４次構造（サブユニット構造）をとりますか。

(無題) 削除/引用 No.9555-6 - 2021/03/05 (金) 14:28:01 - おお キネティクスでなんかカックンってなるなぁとおもったら気泡だったというような記憶があったような気がします。一旦OD値の変化が鈍くなって、また変化の勾配が大きくなるというのは泡が上に抜けたからのような見え方でもあります。あるいは対流なんかでOD値の濃いところとかが移動したりしているのかもしれませんね。 ところでエステラーゼのこの手のアッセイをかんたんにググってみたけど、取っている時間のウインドウが広すぎるのでは。もちろん対象などによって実験条件は違ってくるわけだし。 https://www.bmglabtech.com/enzyme-kinetic-measurements-performed-on-a-bmg-labtech-microplate-reader/ これなんか１分半ぐらいまでしか測ってないし、 http://2013.igem.org/Team:Imperial_College/Enzyme_Kinetics これは最後のグラフ以外は１０分ぐらいまで、 あなたのばあいは５、６分までで十分ちゃんとグラフがかけそうだし。

ありがとうございました 削除/引用 No.9555-5 - 2021/03/05 (金) 11:28:47 - だるまさん こんにちは。丁寧な御回答ありがとうございました。 気泡や濁りはなかったと思いますが、ｐHの変化については、なるほどと思いました。確かに、生成物として酢酸が生じるので、pH変化の影響の可能性はあるかと思います。基質濃度は一番高い場合0.1Mなので、それなりの酢酸が生じ、50 mMリン酸バッファー（pH 7.4）では緩衝しきれない可能性は十分にあります。どうもありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.9555-4 - 2021/03/04 (木) 21:58:00 - qq セルの中で反応させていて、時間経過を見ているのであれば、反応中にある種の濁りが発生していいたり、気泡が出来ていたりする可能性を想像します。 反応時間を０，５，１０分とそれぞれ変えて、反応停止後に個別に測定しても同じように山と谷になるとは思えないので、その辺りを確認すると良いのではないでしょうか？ nitrophenolのような発色系であれば、pH依存性の発色でしょうから、反応の経過で極端なpH変化がないことも確認すべきではないかな？

追加（図のリンク） 削除/引用 No.9555-3 - 2021/03/04 (木) 21:12:05 - だるまさん 図のリンクはこちらです。 https://drive.google.com/file/d/19OxnmzwBZP-JuSnlhQR9poxO9NtaLyQG/view?usp=sharing

酵素反応アッセイ 削除/引用 No.9555-1 - 2021/03/04 (木) 20:49:56 - だるまさん あるエステラーゼの酵素活性のアッセイを行っています。プロダクト生成はOD405で調べています。 下記リンク（PDF）のように、反応開始から時間経過とともに生成物は増えますが、7分後と15分後あたりで突然一旦反応が停止し、また復活するように見えます。図では分かりにくいですが、基質濃度を振っても同じ傾向が認められます。また、反応開始から測定開始までの時間は時々で多少ずれるので、反応が一旦停止するタイミングは多少異なりますが、複数回実験して再現性があります。基質濃度を下げてOD405値が低い時でも同じパターンになるので、生成物が凝集して沈殿したとかでもなさそうです。 理由として考えられることについて、御意見をいただければ幸いです。

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