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(無題) 削除/引用 No.954-6 - 2012/09/24 (月) 15:26:21 - ~ １、３について確認が取れていない場合の考え方として、 ベクターと、細胞＆導入試薬の組み合わせの2つが不確定要素となりなすよね。 それらのうちの片方が潰せる方法を考えると、足元がしっかりしたトラブルシューティングができます。 遺伝子組換え実験ができて、蛍光顕微鏡があって、昆虫細胞を培養できる環境にいるのでしたら、 他の人が近い実験系を持っていませんか？ また、EGFPをコードするDNA配列はどこから持ってきたのでしょうか？ もとになるプラスミドに昆虫細胞で発現するプロモーターがついていれば、それを入れてみるのも手でしょう。 A. Sf9と遺伝子導入試薬の組み合わせが悪い 　→ラボ内の他のメンバーor近所のラボで、遺伝子導入の実績がある系に自分のベクターを乗せてもらい、ベクターの確認を行う B. 蛍光たんぱく質発現ベクターの設計ミス 　→元のpEGFP発現ベクターを使うか、他の蛍光たんぱく質を発現させた実績のあるベクターをもらい、自分のSf9＋HilyMaxの遺伝子導入系で導入してみる （C. 蛍光顕微鏡の不具合 　　→すでに蛍光たんぱく質が発現している細胞をもらい、自分の蛍光顕微鏡で見てみる 　　→薬剤耐性ベクターを導入して、薬剤のセレクションで遺伝子導入を確認する） また、RT-PCRで転写が確認された場合と、確認されない場合で、どのような対応を考えられているのでしょうか？ RT-PCRで本番の検出をするのでないかぎりは、その結果から考えられる対応策（ベクターの設計確認、別のデザインのベクターを試す、検出系の確認等）は今の時点でできると思いますが。

(無題) 削除/引用 No.954-5 - 2012/09/24 (月) 09:23:19 - B 皆様、書き込みありがとうございます。 TF-3さん 　試薬がsf9に、本当に効くかはわかりませんが、ホームページ（http://dojindo.co.jp/whatsnewsj/newpro/hilymax/hilymax.html）の導入実績細胞種に載っていたので、効果はあると判断しました。 　コンストラクトは、シークエンスをして、プロモーター及びEGFPの配列に変異が入っていないことを確認しておりますので、問題ないかと。 　やはり、光ることが確認されているプラスミドを入手することが必要なのかと考えています。また、mRNAの発現はすぐにでも解析できるので、そちらを先にチェックしておこうと思います。 ~さん >１．ベクター自体がGFPを発現させた実績のあるロットなのか？ 　自作したため、導入実績はありません。 >２．使用した培地は、メーカーが推奨している条件を満たしているものか？ 　培地は無血清培地とのことでしたので、それに従いました。 >３．検出系が動いていることは、ポジコンで確認しているか？ 　今回の実験をポジコンにしようと考えていたため、この実験のポジコンはありません。 おおさん 　翻訳開始点の周りは、taaagccaccATGGTGAGCA、このような配列をしています。認識されると思うのですが…認識して、遺伝子が発現しているか否かはRT-PCRで確認できると思いますので、そちらをやってみようと思います。 　また、調べたところ、cellfectin(Invitrogen)と、Tansfast(Promega)の試薬が、sf9細胞を用いて実績があるようでしたので、それらを検討することも視野に入れておこうと思います。

(無題) 削除/引用 No.954-4 - 2012/09/22 (土) 03:27:06 - おお >[Re:1] Bさんは書きました : > 現在、昆虫培養細胞sf9へプラスミドDNAを導入し、任意のプロモーター解析を行おうと実験しています。まず、アクチンのプロモーター（プロモーター活性があることは確認済みです）にEGFPを連結された遺伝子カセットを含むプラスミドで練習の実験を行っています。しかし、導入方法にリポフェクション（試薬は、Hily Max）を用いていますが、販売元のプロトコールに従って条件検討してもまったく成功しません。 全く光らないならベクターが働いているかも気になってきます。プロモーターが働いても翻訳開始部分が認識されないと発現はしませんし、、、 なにかすでに樹立されて発現すると分かっているプラスミドであればべつですが、そうでなければそういうものを使って系を確かめる必要もあるかもしれません。 http://www.dojindo.com/store/p/35-HilyMax.aspx これですね。S2では入ったという資料がありますが、、、 SF9で実績のある試薬をためすおつもりはあるのでしょうか、、、

(無題) 削除/引用 No.954-3 - 2012/09/21 (金) 16:03:12 - ~ １．ベクター自体がGFPを発現させた実績のあるロットなのか？ ２．使用した培地は、メーカーが推奨している条件を満たしているものか？ ３．検出系が動いていることは、ポジコンで確認しているか？ 何に問題がないことが確認済みなのかが書かれていませんので、その視点から問題点を探してはいかがでしょうか。 書かれている情報だけだと、GFPの1st ATGが欠けていたり、血清入りの培地でDNA-HilyMax複合体を作らせようとしていたり、蛍光顕微鏡のフィルターを間違えていても、同じ現象がみられるかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.954-2 - 2012/09/21 (金) 14:39:24 - TF3 その試薬がSf9に効くことは確認済みでしょうか？ 試薬、さらにはバージョンによって効きが変わるのは結構あることです。 また、Sf9自体へのTransfection効率もよくないのでは、と思います。 また、全く光らないのでしたら、本当にそのコンストラクトは大丈夫なのか、ということも確認する必要があると思います。 他の研究室から、光ることが確認されているプラスミドを貰うとか、mRNAの発現をRT-PCRで調べるとか。

sf9へのリポフェクション 削除/引用 No.954-1 - 2012/09/21 (金) 13:28:51 - B いつもお世話になっています。 現在、昆虫培養細胞sf9へプラスミドDNAを導入し、任意のプロモーター解析を行おうと実験しています。まず、アクチンのプロモーター（プロモーター活性があることは確認済みです）にEGFPを連結された遺伝子カセットを含むプラスミドで練習の実験を行っています。しかし、導入方法にリポフェクション（試薬は、Hily Max）を用いていますが、販売元のプロトコールに従って条件検討してもまったく成功しません。 実験条件 　24well プレート使用。 　プラスミドDNA（環状、約4500bp）　0.5、1、1.5 µg/well 　リポフェクション試薬　1:2、1:4、1:6 　培地交換を4時間の場合と16時間の場合で行っています。 　合計18通りの条件を検討してあります。　 　リポフェクション後、48時間に蛍光観察を行っています。 どなたかアドバイスをいただけないでしょうか？

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