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(無題) 削除/引用 No.9531-3 - 2021/02/22 (月) 18:44:36 - gnx >[Re:2] ぬこさんは書きました : > ベクター側を制限酵素処理後、セルフライゲーションを防ぐため脱リン酸化するのはわかりますが、 > インサートまで脱リン酸化してしまっては、ライゲーションされないのでは！ ご回答していただきありがとうございます！ 説明不足でした、すみません。 ベクター側はBamHIで切りっぱなしでリン酸化されたままになっています。 インサート同士がライゲーションしてコンカテマーになるのを防ぐため、またサイズ分画の手間とロスを減らすためにインサート側を脱リン酸化する…という理屈だったと思います。

(無題) 削除/引用 No.9531-2 - 2021/02/22 (月) 14:23:40 - ぬこ ベクター側を制限酵素処理後、セルフライゲーションを防ぐため脱リン酸化するのはわかりますが、 インサートまで脱リン酸化してしまっては、ライゲーションされないのでは！

コスミドのパッケージングと感染 削除/引用 No.9531-1 - 2021/02/21 (日) 23:20:20 - gnx はじめまして。いつも参考にしております。 コスミドベクターを使ってゲノムライブラリーを作成しようとしているのですが、パッケージング後ファージを感染させてもほとんどコロニーが生えてきません。 パッケージングキットにはgigapackIII XL、ホストにはXL-1 Blue MRF'を使用しています。ファージ全量を感染させても100行くか行かないか、というところで、0ということもありました。 ライゲーションが原因なのかと、ベクターは10kb、インサートは20-30kbで、モル比1:1、1:3、1:5で試しましたが改善されません。ベクターは平滑末端を脱リン酸化してBamHIで切断、インサートはゲノムをSau3AIで部分消化して脱リン酸化したものです。また、リガーゼには問題ないことを確認済みです。 指導教員からは、ライゲーションがうまくいっていないにしろコロニー0はおかしい、SMが古くなっていたり、ホスト調製に使う試薬がおかしいなどの単純な理由ではないかと助言されましたが、同じ試薬を使って一応コロニーが生えた例もあるので、個人的には？という感じです。他にすぐに考えられる原因はあるでしょうか？

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