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(無題) 削除/引用 No.9505-11 - 2021/02/16 (火) 07:40:07 - zeo asan先生、おお先生 大変興味深い書き込みをありがとうございます。 継代を早速行なってみます。 phleomycinなんてものがあるのですね。 すぐに買ってみます。 本当に救われたようです。 ありがとうございます！

(無題) 削除/引用 No.9505-10 - 2021/02/16 (火) 03:26:51 - おお https://www.invivogen.com/phleomycin phleomycinがZeocinに抵抗性をもつものに対しても有効という謳い文句がありますね。これだったらいまのZeo耐性ベクターがそのまま使えるかもです。使用感など私はわかりませんが、使っている人がいるとコメントが貰えれば良いのですが。

(無題) 削除/引用 No.9505-9 - 2021/02/16 (火) 00:14:47 - おお >一度パッセージを挟んでも増えて来る G418とかでも、導入後の選択でなかなか死細胞が剥がれてこないけど、継代するとセレクションが早いですね。 そういえばZeo耐性の細胞と勘違いしてZeoを含む培地で２９３系のCell lineを培養したことがありますが、細胞が剥がれているというより調子がなんかへんだなという感じで２、３日たって継代するとほぼ全滅ということがありました。調子が変という時点でアカンのですが、ばかですね私。

(無題) 削除/引用 No.9505-8 - 2021/02/15 (月) 05:32:11 - asan ゼオシンは死んだ細胞の見分けがつきにくい場合があることで有名ですから、一度パッセージを挟んでも増えて来る細胞がいるかどうかまで確認したほうがいいと思います。 ただし、下のサイトだとゼオシンのセレクションタイムが2-6 weeksとかになってますので、細胞によっては非常に効果が遅い細胞もいるのかもしれません。 https://imanislife.com/sciencetalk/antibiotic-selection-gene/

(無題) 削除/引用 No.9505-7 - 2021/02/14 (日) 22:26:29 - zeo 先生方、ありがとうございます。 zeocinウイルスを感染させる前に、まずは最小の濃度を求めるため、未感染の細胞で濃度を振っています。zeocinが効けば全ての細胞は死滅するはずで、その最小濃度を知りたいです。 MOIを0.2程度で感染させたいため、ウイルスを感染させる際にはタイターを意図的に下げて感染させる予定です。 zeocinには時間を要するのですね。 もうしばらく待ってみます。

(無題) 削除/引用 No.9505-6 - 2021/02/14 (日) 16:53:18 - Nanasi ゼオシンは、細胞によっては非耐性であっても１週間近く生存する場合があります。 ただ、死なないとしても増殖は止まって「巨細胞化」の様に見た目が異常になってくるので効いてるのは分かります（貼付のパンフに写真が載ってると思います）。 １週間くらい経つ頃にはそういうのも大部分は死んで耐性の細胞が残りますが、相当数がしぶとく生き残ってる場合があります。増殖がもともと遅い細胞だとコロニーも小さいだろうし、細胞のもともとの形状によっては見分けるのが難しい場合もあるかもしれませんね。

(無題) 削除/引用 No.9505-5 - 2021/02/14 (日) 16:47:14 - おお ２９３TはG418耐性ですね。SV40 T antigen導入するときにG418を使ってます。 レンチウイルスで導入しているんですか？それならタイターが十分で殆どの細胞に入っている可能性もありますね。

(無題) 削除/引用 No.9505-4 - 2021/02/14 (日) 12:46:53 - s G418か、細胞によりますがhistidinolか。これからやり直すのは現実的でないかもしれませんが、マーカーをloxPにはさんでおいて再利用するのも定法だと思います。 ところで、レンチウイルスで遺伝子導入するのに薬剤選択は必須ですか? すごくtiterが低いのでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.9505-3 - 2021/02/14 (日) 08:27:31 - zeo おお先生 ありがとうございます。 やはり通常用いる濃度はそのあたりなのですね。 培養細胞に使えることが確認できて、良かったです。 多剤ですでに抵抗性になっているため薬剤排出能力が高まるという可能性は考えたことがありませんでした。 もうしばらく様子を見て、それでもだめなら薬剤抵抗性遺伝子を変えるかしようと思いますが、これだけコモンな役勢をすでに使っているので、他にどんな抗生剤抵抗性遺伝子があるのか... ゼオシン自体はシグマから液体のものを購入したばかりなので、濃度や期限も大丈夫です。

(無題) 削除/引用 No.9505-2 - 2021/02/14 (日) 07:05:02 - おお DMEM中でだいたい１００から３００ｕg per mlで使いますね。なんかへんですね。 失礼な話ですけど、濃度計算の確認などしてなかったら見ておいてもいいかもです。 同じ培養溶液でオリジナルの２９３tや他の細胞株でききますか？ 度重なる薬剤選択でP-glycoproteinなど多剤耐性遺伝子が活性しているんでしょうか、、、それにしてもそういうがんでZeocinは選択用マーカーとして使いますけどね、、、

Zeocinについて 削除/引用 No.9505-1 - 2021/02/14 (日) 06:11:13 - zeo よろしくお願いします。 Blasticidin, Puromycin, Hygromycinに抵抗性な3遺伝子導入セルラインを扱っていますが、もう一つの遺伝子を安定導入したく、そこでzeocin抵抗性遺伝子を持つレンチウイルスプラスミドを入手しました。 まずzeocinの至適濃度を求めるため、3薬剤にすでに抵抗性な細胞株に、1000 ug/ml, 750, 500, 250, 200, 100, 50と濃度を振り、死滅に必要な最低濃度を求めることにしました。 ところが2日経っても細胞死が1mg/mlであっても認められませんでした。 ゼオシンを哺乳動物細胞（293T）に用いたことは初めてで、これまで大腸菌にしか使ったことはありませんでした。 大腸菌にゼオシンを使用する際には低塩のLBを用いるお約束を思い出し、ひょっとしたらDMEMでzeocinを使うとzeocinの効きが悪くなるのではないかと思うようになりました。 ゼオシンの切れ味や培地の嗜好性につきご存知の方がいらっしゃいましたら、ご教授いただけますと幸いです。

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