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(無題) 削除/引用 No.950-15 - 2012/09/28 (金) 01:24:38 - (・_・) ベンチ操作中にディッシュに偶発的に入り込んだのか、試薬や培地に汚染源があって系統的に起きているのかをまずあるていどはっきりさせるのがとりあえず大事だわな。とくに後者だといくら無菌操作を注意しても！”＃＄％＆ユ＆’（）だしね。細胞が大きなダメージない範囲で何度もしつこくPBSで洗ってから、菌が混じらないくらいまで段階的に限界希釈してみたら、除菌できるかもしれない。細菌ならば、直接培地がコンタクトしないかぎり、ディッシュ間を伝染する事はないだろうから、そのプレートが原因で他の人の細胞がコンタミすることは現実的にはないとおもうけど、カビだと胞子が飛散するかもしれないから同じインキュベータに入れとくのはヤバいな。でも動いてるならそれは細菌だね。

(無題) 削除/引用 No.950-14 - 2012/09/24 (月) 11:26:03 - ~ インキュベーターの余裕と、原因追及の必要性の比重次第ですが、 フリーズストックが十分に汚染されていれば、試薬を一新して次に起こした時に原因が判明するでしょう。 ただ、弱い汚染の場合は次に起こした場合に試薬側が原因であると判断してしまい、将来そのフリーズストックを使用した際に問題が再発するでしょう。 今回は、次に起こした細胞からKOマウスが得られれば、残りのストックは廃棄しても構わないという細胞かもしれませんが、 自分がラボを離れた後にも残すような細胞であれば、リスクの先送りは避けた方がいいでしょう。 >やはりやつらが見られたので極端な低温にさらされた後でも復活できるものなのでしょうか。 細胞と一緒に凍結したのですよね？ 細胞用に凍結保護剤は入れましたよね？ 凍結保護剤は細胞だけでなく、菌にも作用するでしょう。

(無題) 削除/引用 No.950-13 - 2012/09/21 (金) 19:52:08 - 7744 一度フリーズして液体窒素中で保存した翌日に、遠心後にメディウムで溶かしたものから新しいMEF培地、ゼラチンコート(作製しなおしてオートクレーブかけたもの）とフリーズストックと分けたのですが、やはりやつらが見られたので極端な低温にさらされた後でも復活できるものなのでしょうか。まく前のMEF培地やゼラチンのみのディッシュにはいなかったので細胞内に入った後守られるように耐低温状態になっているということなんてありますかね？ もうちょっとわかりやすい説明をしてもらえると助かるのですが・・・。 例えば、 ストックチューブ一本分の細胞を37℃で融解 mediumにストックチューブの全量を移して遠心 mediumで再懸濁 MEF・ゼラチンコートに分けて播いた 以上の操作をして、MEFとゼラチンの両方がコンタミしていたのであればそれは間違いなく原因は以下の２点。 ・ストックしている細胞がコンタミしている ・mediumがコンタミしている もしMEFとゼラチンをES播く前にPBSでwashしたのであればその可能性も。 ちなみに、特定の細菌を除いて、細胞内に入ることはありません。 サルモネラを手に付けたままES触るとかよほど無茶苦茶しない限り、常在菌の類なので細胞外です。 それに普通に考えて、常在菌の方が細胞よりはるかに強いので、液チ中で保存しようが問題なく生存するでしょう。

細菌のコンタミについて 削除/引用 No.950-12 - 2012/09/21 (金) 17:50:59 - こまたん 皆様ご指摘本当にありがとうございます。とても参考になります。 スピロヘーター！形態としてはくねくねと動いてるようにも見えるのでその可能性が高い気もしますね。常在菌としても生育しているのでこの細菌のコンタミも否定できないですね。 とりあえずまずは培地などの試薬類を新品のものにして次の細胞を起こそうとおもいます。 再度質問で恐縮なのですが、一度フリーズして液体窒素中で保存した翌日に、遠心後にメディウムで溶かしたものから新しいMEF培地、ゼラチンコート(作製しなおしてオートクレーブかけたもの）とフリーズストックと分けたのですが、やはりやつらが見られたので極端な低温にさらされた後でも復活できるものなのでしょうか。まく前のMEF培地やゼラチンのみのディッシュにはいなかったので細胞内に入った後守られるように耐低温状態になっているということなんてありますかね？

(無題) 削除/引用 No.950-11 - 2012/09/21 (金) 16:45:12 - おお >[Re:10] ~さんは書きました : > 全廃棄の前に、各試薬を5日以上インキュベートしてみては？ > （抗生物質抜きで、PBSやトリプシン等は適当な培地で希釈して） > > そこでどれかの試薬がコンタミしていることが確認できればいいですけど、 > そうでなければ細胞のフリーズストック自身のコンタミも疑うことになるでしょう。 それよりインキュベーターでコンタミをかうのもいやでしょうし、バイチとかすべて一新して細胞を起こして細胞が大丈夫か確認した方が直接的ではないかなぁ.

(無題) 削除/引用 No.950-10 - 2012/09/21 (金) 09:18:26 - ~ 全廃棄の前に、各試薬を5日以上インキュベートしてみては？ （抗生物質抜きで、PBSやトリプシン等は適当な培地で希釈して） そこでどれかの試薬がコンタミしていることが確認できればいいですけど、 そうでなければ細胞のフリーズストック自身のコンタミも疑うことになるでしょう。

(無題) 削除/引用 No.950-9 - 2012/09/21 (金) 01:54:25 - おお http://blogs.yahoo.co.jp/pitaya1973jp/archive/2011/9/8 スピロヘータみたいいなやつでしょ? 病原性のものから、常在菌のものまでいろいろ種類があるようです。

細菌のコンタミについて 削除/引用 No.950-8 - 2012/09/20 (木) 22:40:50 - こまたん 皆様ご指南ありがとうございます。 とりわけ、7744様のご指摘は大変的を射ておられ、かなり自分の認識も甘いものだったのかと、改めて感じました。ESワークに慣れて一度インジェクションまで持って行っているので少し油断があったのだと思います。 大腸菌の可能性も考慮して、今後無菌操作と試薬へのコンタミに注意して実験しようと思います。

(無題) 削除/引用 No.950-7 - 2012/09/20 (木) 22:06:30 - 7744 まずすることはES細胞の培養に使用するmedium/PBS/trypsinは全廃棄。(大丈夫と確信持てる物以外) 念には念を入れるのであれば、ES用のFCSやmediumu作製に使用する試薬のコンタミチェック。(簡単には捨てられない物など) 私の経験上、インキュベータにカビが生えたり他のプレートがコンタミしていたとしても、他のプレートまで影響を与えることはほぼ無いと感じます。 なのでおそらく原因は、 ・共通で使用している試薬をあなたを含めた誰かがコンタミさせた。 ・あるいはあなたが直接コンタミさせた。 この二点かと。 前者の場合は使用者全員に無菌操作を徹底させるしかないでしょう。 もしそれでもいい加減にやるバカがいる場合は、上司に言うなりしてそいつにはESを触らせないようにすべきです。ラボのためです。 もし後者であれば、あなたが気を付ける以外ないでしょう。 ESの培養は今まで何人にも指導してきましたが、通常の細胞を抗生物質入りの培地で培養している癖なのか、意識が低いのか、教えても教えても無菌操作が甘いです。はっきり言ってなめすぎている奴が多いです。 あなたは大丈夫ですか？ 本気で初心に返って自分の無菌操作を見直してみてください。

(無題) 削除/引用 No.950-6 - 2012/09/20 (木) 21:47:44 - 7744 おそらく大腸菌

(無題) 削除/引用 No.950-5 - 2012/09/20 (木) 21:31:38 - qq あなたの培養系から薬剤耐性以外の抗生物質を全て取り除いて培養する事をお勧めします。抗生物質入りで培養している全ての培地、PBS、trypsinは、コンタミしている可能性を除去できません。まっ、極論ではあるけどね。

(無題) 削除/引用 No.950-4 - 2012/09/20 (木) 21:19:30 - えっと ちなみにソイツらをアンピシリン、ストレプトマイシン入りの培地で培養してみては。

細菌のコンタミについて 削除/引用 No.950-3 - 2012/09/20 (木) 20:57:05 - こまたん 注意点はそうする他ないですよねorz ただ今後のことも踏まえてこの細菌が何者かを予想していただきたいのが本件の目的だったのですが、言葉たらずでしたね。

(無題) 削除/引用 No.950-2 - 2012/09/20 (木) 20:53:29 - えっと 注意が不十分だとご自分で仰ってますよね。 >今後こいつらを防ぐための注意点をご教授お願いします。 最大限の注意を払ってくださいとしか言えないのでは？

細菌のコンタミについて 削除/引用 No.950-1 - 2012/09/20 (木) 20:41:26 - こまたん はじめまして、いつも勉強させていただいています。 現在ノックアウトマウス作製するに当たってESクローンを培養しているのですが、細菌？によるコンタミが発生してしまいました。ES細胞の培養では抗生物質が使用できないこともあり、カルチャーには十二分に注意を払ってきたつもりなのですが不十分だったのか、やらかしてしまいました。 細菌の特徴は400倍の倍率で顕微鏡下ではっきりと目視することができ、線状でぐにゃぐにゃと体全体をくねらして動いています。 他の細胞では抗生物質が入っていることもあるのですが、同じインキュベータ内の他の細胞は無事なのでインキュベータには問題はないと思われます。 正直いち早くマウスを作製したいので出来るだけクローンを取っておきたいので、今回のコンタミには非常に落ち込んでいます。 ゼラチンコーティングしたディッシュにまくと翌日には増殖していたのですが、MEFの方では5日間経っても増えて来なかったので、ゼラチンに問題があると考えて作製しなおして、再度フリーズしておいたターゲティングしたESを起こしたのですが、5日間経ったMEFの上にまいたディッシュにもやつらが見えてしまいました。 はたして、この細菌は何者であり、今後こいつらを防ぐための注意点をご教授お願いします。

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