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IPTG, X-gal 事前に混ぜちゃダメ？ トピック削除
No.95-TOPIC - 2012/01/27 (金) 14:45:55 - mikan
コロニーの青白判定をするため、抗生物質入りプレートにIPTG溶液とX-gal溶液を塗布しました。

いつもならX-gal溶液を塗布した後に、追ってIPTG溶液を塗布、の様に２液を“別々に”プレートに塗るのですが、ある時あらかじめX-gal溶液をIPTG溶液を混ぜておいてプレートに塗布したことがありました。

しかし２液を同時に塗布したプレートでは、実際は青に相当するコロニーもあったにも関わらず（別の方法で調べてわかっています）、生えてきたコロニーは全て白になってしまっていました。

X-galやIPTGの失活はありません。濃度も適正です。
（その後同じ溶液を使って、今度は“別々に”塗布したらきちんと青白判定することができた。）

予め２液を混ぜてしまったことが原因か、
例えばX-galの溶媒であるDMFがIPTGを失活させるだとか、
水に溶けているIPTGと混ぜることでX-galが析出してしまうだとか、
色々考えてネット検索もしてみたのですがその様な記述が見つけられませんでした。

今後は別々に塗布すれば問題は起こらなさそうなので困らないのですが、
混ぜるとなぜうまくいかないのか気になるので、ご存知の方や同じ様な経験がある方は教えてください。
　
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(無題) 解決済み 削除/引用
No.95-5 - 2012/01/28 (土) 20:33:57 - mikan
みなさま書き込み有り難うございました。
目に見えるほど析出していれば気付いて、それを使うことは無いのですが、
（自分の記憶では析出していなかったと思っている）
他に理由が考えられなかったのでそう想像してみました。

> IPTG 100mM in H2O, 8 ul / 10 cm plate
> X-Gal 20 mg / ml in DMF, 40 ul / 10 cm plate
> です。

> 溶媒の比の問題？

H2O : DMF = 1 : 5 なのですね。
私は 1 : 2 位で調製した記憶があるので、Harmoniaさんのおっしゃる様に溶媒の比の問題なのかもしれません。

「塗布する順番はX-gal→IPTG→大腸菌とし、あらかじめ混ぜずに別々に塗布すること。」と書かれた文献を見つけて（しかしその理由への言及は無し）何か意味があるのかと気になったのですが、実質あらかじめ 1 : 5 で混ぜてうまくいくならば特に枚数をこなさなければならない時に便利と思います。

（まあその文献ではもしかしたら、X-galの溶媒DMFに毒性があるから大腸菌と混ぜるな、という意味で書かれているだけなのかもしれませんが。文献は見失ったのでここに引用ができません。）

次回何かのついでに 1 : 5 程度の比で試してみます。

(無題) 削除/引用
No.95-4 - 2012/01/28 (土) 16:33:49 - Harmonia
（前の方の書き込みを否定するつもりではありません。悪しからず）

ぼくは20年近く（最初に教わってからずっと）、混ぜてから派です。
問題は起きていません。

IPTG 100mM in H2O, 8 ul / 10 cm plate
X-Gal 20 mg / ml in DMF, 40 ul / 10 cm plate
です。

1.5 ml エッペンなどでIPTG とX-Gal を混ぜ合わせ、コンラージ棒で塗り広げています。
溶媒の比の問題？

(無題) 削除/引用
No.95-3 - 2012/01/28 (土) 00:12:59 - 中年
お書きになっているように、水に溶けているIPTGと混ぜることでX-galが析出して、プレート全体に均一に塗り広げられていないことが原因でしょう。

析出することは、ご自身でご覧になっているはず。それを均一に塗り広げることが難しい（結果として均一でない）ことも、塗布後のプレート表面を見れば分かると思いますが。

(無題) 削除/引用
No.95-2 - 2012/01/27 (金) 17:07:06 - R
あらかじめ混合したことはありませんが、
プレートの同じ所に両方を滴下してから同時に塗り広げていました。

また、シャーレに固める前に培地に混ぜてからプレートを作製しても問題ありませんでした。

IPTG, X-gal 事前に混ぜちゃダメ？ 削除/引用
No.95-1 - 2012/01/27 (金) 14:45:55 - mikan
コロニーの青白判定をするため、抗生物質入りプレートにIPTG溶液とX-gal溶液を塗布しました。

いつもならX-gal溶液を塗布した後に、追ってIPTG溶液を塗布、の様に２液を“別々に”プレートに塗るのですが、ある時あらかじめX-gal溶液をIPTG溶液を混ぜておいてプレートに塗布したことがありました。

しかし２液を同時に塗布したプレートでは、実際は青に相当するコロニーもあったにも関わらず（別の方法で調べてわかっています）、生えてきたコロニーは全て白になってしまっていました。

X-galやIPTGの失活はありません。濃度も適正です。
（その後同じ溶液を使って、今度は“別々に”塗布したらきちんと青白判定することができた。）

予め２液を混ぜてしまったことが原因か、
例えばX-galの溶媒であるDMFがIPTGを失活させるだとか、
水に溶けているIPTGと混ぜることでX-galが析出してしまうだとか、
色々考えてネット検索もしてみたのですがその様な記述が見つけられませんでした。

今後は別々に塗布すれば問題は起こらなさそうなので困らないのですが、
混ぜるとなぜうまくいかないのか気になるので、ご存知の方や同じ様な経験がある方は教えてください。
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