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核内移行シグナル トピック削除
No.9494-TOPIC - 2021/02/10 (水) 12:24:22 - ももんが
スクリーニングで取れてきたとある中間系フィラメントの配列を解析したところ核内移行シグナルが存在しているのですが、染色をしても核内にあるか不明瞭です。
核と細胞質の分画のウエスタンをしてもわずかにバンドが見えるのですが、バンドは極めて弱いです。

核内移行シグナルはあったとしても核内に運搬されているとは限らないのでしょうか？

また最終的に核内にあることを確定させるには、どういう実験が考えられるのでしょうか？核内に発現させて機能解析をするなどは当然考えられますが、本当にエンドジェナスな核内タンパク質が存在していて機能していると言い切るのはなかなか難しい気がしています
　
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No.9494-5 - 2021/02/15 (月) 05:44:37 - asan

ちゃんとやるなら、その核移行シグナル配列をつぶしたら局在が変わることを示すしかないでしょう。別にIFだろうが分画 WBだろうが、レビュワーが納得すればそれで証明にはなりますが、刺激依存的とかそういう移行を想定してるならばそういう生理的条件を示してやる必要があるかと。

レプトマイシンとかで局在がどうなるか、とかそいう実験は比較的簡単にできるのでやる人は多いかもしれません。エンドレベルでのIFが難しければまずはGFPタグをつけるとかFLAGなんかの見やすいタグつきのものを過剰発現した細胞株でも作ってそれで局在を示せばいいと思います。

血球細胞とか核との判別がわかりにくい細胞でしか見えないなら高解像度の検証が必要ですが、細胞特異性がないならばHeLaとかCOS細胞とか核染色し易い細胞でIFの条件を詰めればいいと思います。

(無題) 削除/引用
No.9494-4 - 2021/02/11 (木) 06:59:14 - 774
１）何かしらの刺激が入った時だけ核移行する可能性
２）核と細胞質をシャトルしてる可能性
CRM1依存的に核外輸送されてたら、LMBで阻害して核に溜まるのを確認できるはずです。
その他の場合だと、阻害剤ってあるんでしょうか？

(無題) 削除/引用
No.9494-3 - 2021/02/10 (水) 14:37:49 - おお
>[Re:1] ももんがさんは書きました :

> 核内移行シグナルはあったとしても核内に運搬されているとは限らないのでしょうか？

そらどのNLS予測の論文をみてもFalse positiveが示されていますから、予測が外れていることもあるということではないでしょうか。
>
> また最終的に核内にあることを確定させるには、どういう実験が考えられるのでしょうか？

そのNLSシグナルと思われる配列がちゃんとワークしているか。GFPとそのNLSを含むドメインを融合したりして見ている実験がよく見られますよね。まあそれでも不十分ではありますが。

importinやtransportinと相互作用があるのかも核移行を示唆できるデーターにはなると思う

たとえば核を更にフラク所ネーションしてどこかのフラクションに豊富に見れるとか言うのもやり方かも知れません.

Interactorのデーターベースなどで、パートナーやコンプレックスに核にある蛋白がありますか？そういうのがあれば機能面でも切り口が見つかるかもしれないし。

>核内に発現させて機能解析をするなどは当然考えられますが、本当にエンドジェナスな核内タンパク質が存在していて機能していると言い切るのはなかなか難しい気がしています

核内に発現させてといっても方法論がピンときませんけど、、、NLSを破壊した蛋白をコードする遺伝子をノックインして核内に行かせないようにして表現型を見てみるとか。。。

スクリーニングしたんだったら、何らかの機能に基づいてしたのだと思うのだけど、そこに沿って詰めていく方はどうなの？

(無題) 削除/引用
No.9494-2 - 2021/02/10 (水) 12:41:41 - ema
＞染色をしても核内にあるか不明瞭です。
観察手法は何なのでしょうか。蛍光顕微鏡では判りにくいです。
高倍率の共焦点蛍光顕微鏡もしくは超解像のPALMなどで局在確認してもうまくいかなかったという事でしょうか。
https://www.zeiss.co.jp/microscopy/products/elyra-7-with-lattice-sim-for-fast-and-gentle-3d-superresolution-microscopy.html

核内移行シグナル 削除/引用
No.9494-1 - 2021/02/10 (水) 12:24:22 - ももんが
スクリーニングで取れてきたとある中間系フィラメントの配列を解析したところ核内移行シグナルが存在しているのですが、染色をしても核内にあるか不明瞭です。
核と細胞質の分画のウエスタンをしてもわずかにバンドが見えるのですが、バンドは極めて弱いです。

核内移行シグナルはあったとしても核内に運搬されているとは限らないのでしょうか？

また最終的に核内にあることを確定させるには、どういう実験が考えられるのでしょうか？核内に発現させて機能解析をするなどは当然考えられますが、本当にエンドジェナスな核内タンパク質が存在していて機能していると言い切るのはなかなか難しい気がしています
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