>[Re:1] poorlabさんは書きました :
> リアルタイムRT-PCRをしています。
> （Total RNA抽出して、ｃDNA合成、リアルタイムRT-PCRです）
正式には、２step 定量RT-PCRです、英語なら、2 step quantitative reverse transcription PCRです。卒論、修論時期なのであえて書きました。略語なら2 step qRT-PCRです。一般的には２stepの部分は省略可能です。リアルタイムの略語がRTなので、誤用が日本だけで無く世界で広まっているのが難点ですが。
> > 機器が1台しかありません。しかし測定したいサンプル数と遺伝子数が多いため、９６ウェルプレートは３，４枚に及びます。そこで、SYBRやプライマー等、測定直前の96ウェルプレートを用意しておき、1枚めの測定（およそ2h）の間は-20℃の冷凍庫に入れておき、1枚目測定終了したら即座に冷凍しておいた2枚目をセットして測定する、という方法を考えました。
考えるのは良いことです、偉いですねぇ〜。が、それによる測定誤差がどの程度あり得るかどうかは、確認しましたか？凍結融解により、cDNAが壊れる可能性については？凍結融解のネガティブな可能性を避けるのであれば、短時間なら4℃の保存の方が良いのでは？DNA polが3'-5' exo活性がある酵素（例えば東洋紡のKOD系とか）ならｃＤＮＡを分解しますけど、大丈夫ですか？
> 単純に都度SYBRやプライマーを混ぜるのが面倒なので、同じ作業は一気にしておきたい、というだけの理由なのですが、問題ありそうですか？
貴方の都合は、サイエンスの結果には関係ありません。それを行って良いエビデンスを示して下さい。無ければ、そのデータは信用に足るデータでは無いです。PCRの間隔が2時間も有るのなら、普通は「用事調製」でしょう。Taq polは基本DTTとか必要ないけど、使用するDNA合成酵素によってはDTTが必須ですし、SYBERなら遮光保存も必要ですよ。なので、すぐに変成するする構成物があれば、用事調製以外の選択肢は無いですよ。
> 冷凍した96ウェルプレートは測定前に少し解凍させる必要があるかな？程度にしか問題視してないのですが、どうでしょうか。
知らんがな。問題あったとき、自己責任で対処して下さい。匿名のネットで得た情報で、もし間違っていた場合、貴方はどのように貴方の指導教官に回答するんですか？私が貴方の指導教官で、ネットでそう教えられました、と答えられたら、私のそれに対する回答は、「では来年も。基礎から頑張ってね♡」で、留年確定です。指導教官が貴方と同じ回答なら、責任は指導教官にあるので、ネットで質問せず、指導教官に聞いて下さいね。 |
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