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(無題) 削除/引用 No.9481-10 - 2021/02/06 (土) 12:54:53 - s モル比に凝るのは意味がないというのは、プラクティカルにはそうかもしれないけど、モル比を聞かれたとき答えられるぐらい丁寧に実験する必要はあると思う。少なくとも初心者のうちは。ところで、ベクターのほうを多くしろというプロトコルを見たことがないのだけど、最初の質問者の方は何を見たのだろう？ あと、ゲル抽出がスメアになる理由が考えつかないし、それが再現性よく(？)起きるようでは、どんな実験もうまくいかないと思う。ゲル抽出は最も最初に習得すべき技術。

(無題) 削除/引用 No.9481-9 - 2021/02/06 (土) 11:42:07 - Skeptic 泳動度に関してはおっしゃるとおりですね、すみません。 それはそれとして、初心者には切り出しは勧めません。上手くいかないという学生さんの精製ベクター断片の標品を泳動してみたら一部がスメアしていたということを何度も経験しています。

(無題) 削除/引用 No.9481-8 - 2021/02/06 (土) 10:20:28 - G25 変性プラスミドをOCと勘違いしているようですが、違いますからね。古くからghost bandとかghost plasmidという名で知られていたもので、移動度はcccとほぼ同じです。Molecular Cloningなど実験書などでも触れられています。

(無題) 削除/引用 No.9481-7 - 2021/02/06 (土) 08:15:38 - Skeptic 私自身は基本的にはベクター側はゲル抽出しないし、それで問題になったことはありません。また、、多くのベクターのサイズだと、ssDNAになってしまった分子種はともかく、変性dsDNAとone cut分子のゲル上の泳動度は近いので十分な分離が得られるとも思えません。 初心者にとっては切り出しに伴う問題（UV曝露、nicked分子の増加、sticky endの分解など）の方が大きいと考えています。

(無題) 削除/引用 No.9481-6 - 2021/02/05 (金) 22:19:46 - G25 > そもそもベクターを切ったあとゲル抽出する必要性があるのでしょうか。 あります。 制限酵素消化は完璧ではありません。 アルカリ法で精製したプラスミドは多かれ少なかれ制限酵素消化に耐性の分子を含みます。部分変性したプラスミドが生じ、それは制限酵素で切れないためです。変性したプラスミドも大腸菌に取り込まれると正常に機能します(複製には支障ないため)。 微量でもそういう分子があると非組換え体のバックグラウンドを上げます。ゲル電気泳動精製は未消化のプラスミドを排除するのに効果的です。 まあ、十分に組換え体ができていて、多少非組換え体のバックグラウンドがあっても楽勝ならやらなくてもいいですが、そうじゃないこともままありますから。

(無題) 削除/引用 No.9481-5 - 2021/02/05 (金) 21:56:10 - KIT そもそもベクターを切ったあとゲル抽出する必要性があるのでしょうか。制限酵素反応にSAPをそのまま追加して脱リン酸化しておけば、ゲル抽出する必要もないと思います。カラム精製で十分です。 インサートもPCRで余計なバンドでも見えてなければ、制限酵素で切ったあと、カラム精製するだけです。 あとクローニング用ベクターなら大丈夫だと思いますが、そうでないなら、XbaIのdamメチル化(GATC)はないか、確認しましょう。

(無題) 削除/引用 No.9481-4 - 2021/02/05 (金) 18:33:27 - G25 そこそこ出るはずのコロニーがさっぱり出なくなる原因となるものの一つはDNAのUV被曝です。 一般的に、プライマーにデザインした制限酵素サイトを制限酵素消化するのには、末端にいわゆる「足場」となる余剰のヌクレオチドが必要であるのは他の方の指摘の通り。ただし、何塩基対の余剰を必要とするかは制限酵素によります。 足場をつけたとしても、プライマーにデザインした制限酵素サイトは切れにくいものです。経験上、大多数の分子は切れ残っています。 多分、サイクル過剰だとそうなりやすい。サイクル過剰だとPCR産物の解離、再対合が主となって、二重鎖のレジストリがおかしくなってくるからだと思っています。クローニング目的ならサイクル数は控えめにするのがいいでしょう。 ベクター対インサートの比率なんかにこだわるのは労力の無駄。 なんか、こと大げさにかたる人や記述にであうことがありますが。 比率はインプットしたDNAに対するアウトプットの「効率」を左右しますが、効率が落ちたってゼロになるものではありません。また、ゼロだったものが比率を変えるだけで取れるようになるというものでもない。せいぜいコロニーが1000個でるか100個出るかの違いであって、一個のあたりが取れればいい実験ではどっちだっていい。

(無題) 削除/引用 No.9481-3 - 2021/02/05 (金) 17:11:58 - み 前のコメントにもあるように制限酵素認識サイトの側方に3base余分につけておいた方が良い。っというか僕は毎回付加している。 要するにPCR産物の制限酵素サイトが切れていない可能性。 ゲル注とおっしゃっているが、ゲル注は何を使用しているのだろうね。 下手な人に限って詳細を書いてくれない。 考えが及んでいないのだろう。 バンド検出する際にUVをバシバシに照射しているとかないだろうね。 あなたが回収したinsertとvectorに関して、ligationの前後でサンプルの一部を泳動して実際に繋がってるか確かめもしないのかな？ 各ステップで問題なく反応や回収できているのか確かめるのが筋でしょう。 あとは、プロトコールは全て問題ないが、手技が未熟で単純に効率が悪いだけということもある。院生でも3kbを超えたとたんに全く入らなくなる人がたくさんいたよ。

(無題) 削除/引用 No.9481-2 - 2021/02/05 (金) 16:50:42 - がぁが いろいろなことが原因となるので、過去のトピックも参考にしてください。 制限酵素は種類によっては、認識配列の両側に数bpの配列がないと切断しないようですが、プライマーの配列は問題ないでしょうか。PCR産物を、まずT-ベクターか何かにクローニングしてから制限酵素消化してゲル抽出、とするとうまくいくかもしれません。 4kbpを入れるのは、結構難しい部類になるのではないかと思います。ライゲーションの効率だけでなく、形質転換効率（コンピテントセルの性能）も高くする必要があると思います。

コロニーが増えない、当たりがない 削除/引用 No.9481-1 - 2021/02/04 (木) 18:48:27 - 大腸菌と仲良くなれない 制限酵素処理（EcoRI,XbaI）後、ゲル抽したTiベクターに制限酵素サイト付きプライマーで増幅後、制限酵素処理してゲル抽した約４kbの遺伝子断片をライゲーション後形質転換してプレーティングしました。しかし、コロニーの数がとても少なく、かつコロニーPCRを行ったところ全くと言っていいほどインサートを持っていません。 ライゲーションはTakara DNA Ligation Kit LONGを使っています。DH５αに形質転換（５分）後、３０秒ヒートショックし、SOCを９００μl加えて３７℃１h振盪し、Km入りの培地にプレーティングしています。 ライゲーション時のベクターとインサートの比率は、説明書に等量程度（ng）で使用すると良い結果が得られることが多いが、最適なベクターとインサートのモル比はインサートの長さにより異なる。ベクター：インサート＝２：１〜１０：１のモル比で条件を検討してみて。とあるので何となく等量程度で使用しています。ベクターDNAの使用量は２５〜５０ngと書いているのでバンドの濃さを見て５０ng程度で使用しています。 何を直せば良いのか全くわからず困っております・・・。

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