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(無題) 削除/引用 No.9471-7 - 2021/02/04 (木) 10:13:57 - qq 凝集体といえばアミロイドを思いつきます。 抗体のアミロイドもあるそうですが、さむさんの場合に当てはまるのか分かりません。 培養中に生じると考えているようですので、ハイブリドーマか何かなのでしょうかね。ゲルろ過で高分子量に来る＋プロテインAに結合しないということは、培養上清をゲルろ過してウェスタンすると、高分子領域に抗体が検出されるのに、proteinA-Sepharoseには結合しないということなのかな。 全てが、抗体凝集体化しているのでしょうか、それとも普通のIgGもあるのだけど凝集体が気になるのですか？ １）IgGだと思っていたら、IgMだったということはないですよね？ ２）高分子量画分にIgG L-鎖もあるのだろうか？ ２）一応、ProteinGを試してみてもよいのではないか？ と思います。

(無題) 削除/引用 No.9471-6 - 2021/02/04 (木) 00:57:50 - おお まず、抗体が変性しないと考えるのは無理があります。 根拠 変性した抗体を認識しないAnti-IgG antibodyが存在する。 熱力学的、光化学的手法により構造変化が検出されている。 ただし、尿素やグアニジンにより変性した抗体はRenatureしやすいと言われています。 次に変性様式は一種類でない。 酸、熱、酸化で抗体の凝集体が見られるようです。凝集するということはIrreversibleだから変性状態から元に戻れないから。また酸化では明らかに化学的修飾が施されてしまっている。（ただし酸は一時的なら抗体は比較的大丈夫でProtein Aなどから溶出するときに使われるが、長期的にExposureしないように、溶出した溶液を受ける器にアルカリ性バッファーなどを入れておくこともおおい） ということから、凝集体がFcがすべて内向きになっているためにProtein Aなどに結合しないというのは懐疑的

(無題) 削除/引用 No.9471-5 - 2021/02/03 (水) 22:22:24 - 　βhじ 放射ラベルProtein Aを２次抗体の代わりに使ってimmunoblottingをしていた時、内在性のIgG H鎖の強いシグナルを経験したことがあります。なので変性したIgGとも反応はすると思います。尿素で抗体を完全変性したとして、Protein Aカラムによる抗体の精製は尿素非存在下で行うということですね。たぶん高濃度( タンパク質を完全に変性させるためには尿素なら8Mくらい、GdnHClなら6Mくらいの高濃度が必要です。）の尿素存在下ではprotein A自体が変性して結合活性が維持できないと思います。SDS等と異なり、 尿素や塩酸グア二ジンで変性させても希釈や透析で尿素の濃度を下げることで再び再生することが多いです。ただ天然状態の元の形を復元して活性も回復するか、中途半端な形に戻るかは個々のタンパク質や再生条件により異なりますので一概には言えません。後者の場合はしばしば凝集し不溶化する場合もあります。溶けなくなると先に進めません。NP-40とかTX100のような緩い界面活性剤を最終濃度0.5%くらいで添加した適当な中性Bufferに透析して12~24時間くらいかけてゆっくり尿素濃度を少なくとも1/10以下まで下げるといい感じで再生するかもしれません。尿素は透析で容易に抜けます。

(無題) 削除/引用 No.9471-3 - 2021/02/03 (水) 09:49:35 - qq 抗体凝集体って、何を考えています？

(無題) 削除/引用 No.9471-2 - 2021/02/03 (水) 05:07:53 - おお >抗体を尿素などで変性した場合にもプロテインAは結合能を保持するようです（サーモHP） >そうするとFc領域のエピトープ（？）が露出している限りはあらゆる状態の抗体はカラムに引っかかるはずです 飛躍し過ぎでは？それならどんな条件でもカラムから溶出できないともいえる。

抗体凝集体に対してプロテインAの親和性は保持されるのか 削除/引用 No.9471-1 - 2021/02/02 (火) 20:37:32 - さむ いつもお世話になっています。 過去ログになかったのでタイトルのような疑問について質問させてください。 抗体（サブクラス等の細かい話は省きます）のFc領域に対して親和性を示すプロテインAカラムがありますよね 抗体を尿素などで変性した場合にもプロテインAは結合能を保持するようです（サーモHP） そうするとFc領域のエピトープ（？）が露出している限りはあらゆる状態の抗体はカラムに引っかかるはずです ただ凝集体のパターンによって全くエピトープが表面に出ずにパストスルーに出てしまうことはあるのでしょうか？ またはコンプレックスになることでプロテインAが近づけなくなるなど メーカーからの回答待ちですがこれまでの経験からあまりはっきりとした答えはもらえないかと思うのでお知恵を貸してください

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