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iPS細胞の未分化維持 トピック削除
No.947-TOPIC - 2012/09/20 (木) 00:43:42 - Cu
平素より勉強させていただいております。
拙い文章で失礼しますが、iPSの培養に関して質問させて頂きます。

PMEF（P3）を購入・培養し、マイトマイシンC処理後に0.1%ゼラチンコートをした6 well plateにfeederとして播種。そこに理研より入手したマウスiPS細胞をfeederに播種して培養を行っております。

iPSの分化誘導実験を行うため、まずは未分化iPSの分化マーカーの陰性をRT-「PCRにより確認しようとしましたが、陽性となり、既に分化細胞が存在している可能性が示唆されました。

原因として以下の３点を考えました。
１.フィーダーが機能していない
２．継代数が多すぎる
３.培養条件が悪い

そこで私の質問は、
feederとして機能するMEFは何継代数までのものがよいのか。
iPS細胞は継代数をどのくらい重ねると未分化を維持できなくなってしまうのか。容易に維持できないようなものなのか。
未分化を維持するためにどのようなことに注意すればよいのか。
でございます。

是非とも皆様にご助言いただけると幸いです。
何卒よろしくお願い致します。
　
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(無題) 削除/引用
No.947-8 - 2012/09/21 (金) 02:02:19 - Cu
あい様

CHIR99021、PD0325901という２つのインヒビターのことではないかと解釈しております。

(無題) 削除/引用
No.947-7 - 2012/09/21 (金) 02:00:46 - Cu
お返事いただき有り難うございます。

現在の培養液は以下の組成となっております。
DMEM base
15% ES grade FBS
1× NEAA
1mM sodium-pyruvate
2mM 2-ME
1% P&S
1000 U/mL LIF



＞あかね様、PCR様

上記培地に2iしても問題ないでしょうか。
フィーダーフリーで培養行う知識や技術が乏しいため、まずは継代数が少ない（P4）のMEFを解凍し再度MMC処理によりフィーダー作成後に2i/LIF（+）培地にて培養してみたいと思います。

MEFですが、以前のトピックで継代数は4~6のものがフィーダーに適しているという記述が少し見られたのですが、この記述は正しいのでしょうか？

(無題) 削除/引用
No.947-6 - 2012/09/21 (金) 01:41:50 - あい
後学のために教えてください。2iとはなんですか。すみません門外漢ですが気になりますm(._.)m

(無題) 削除/引用
No.947-5 - 2012/09/20 (木) 10:27:48 - おい
おい、チ○コ！
おまえにはモラルがない。
そんなやつがまともな研究ができると思えない

(無題) 削除/引用
No.947-4 - 2012/09/20 (木) 06:50:37 - PCR
RT-PCRで増えたからといって、分化していると言い切れるわけでもないと思うのですけど。
何と比較して、陽性／陰性を判断するかが重要です。
分化した細胞は増殖が遅くなるので、継代数を重ねて問題になるのはどちらかというと多分化能の消失（キメラマウス産生能の低下）、染色体異常による増殖促進ではないかと思います。

フィーダーの質はクリティカルです。
ちゃんとしたフィーダーを調製できないなら、2iとかLIFを入れてフィーダーフリーで培養した方が安定します。
何のバックグラウンドもないラボでiPS細胞の研究を始めようというのであれば、まずはどこかのラボに勉強にいくのが近道です。

(無題) 削除/引用
No.947-3 - 2012/09/20 (木) 05:52:52 - あかね
mediumに2i入れなさい。

947-2の方、下品な名前はやめてほしいです。
多くの女性研究者が見ていることを忘れないでほしいです。

(無題) 削除/引用
No.947-2 - 2012/09/20 (木) 01:42:33 - チンコ
この手の質問はfaqですね。

iPS細胞の未分化維持 削除/引用
No.947-1 - 2012/09/20 (木) 00:43:42 - Cu
平素より勉強させていただいております。
拙い文章で失礼しますが、iPSの培養に関して質問させて頂きます。

PMEF（P3）を購入・培養し、マイトマイシンC処理後に0.1%ゼラチンコートをした6 well plateにfeederとして播種。そこに理研より入手したマウスiPS細胞をfeederに播種して培養を行っております。

iPSの分化誘導実験を行うため、まずは未分化iPSの分化マーカーの陰性をRT-「PCRにより確認しようとしましたが、陽性となり、既に分化細胞が存在している可能性が示唆されました。

原因として以下の３点を考えました。
１.フィーダーが機能していない
２．継代数が多すぎる
３.培養条件が悪い

そこで私の質問は、
feederとして機能するMEFは何継代数までのものがよいのか。
iPS細胞は継代数をどのくらい重ねると未分化を維持できなくなってしまうのか。容易に維持できないようなものなのか。
未分化を維持するためにどのようなことに注意すればよいのか。
でございます。

是非とも皆様にご助言いただけると幸いです。
何卒よろしくお願い致します。
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