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(無題) 削除/引用 No.9463-10 - 2021/02/01 (月) 11:52:49 - s カウントデータのサンプリングエラーのみによるばらつきはポアソン分布なので、そもそも左右対称じゃないのでは(特に8コピーとか小さい値の場合)、というつっこみはさておき。 分子生物学的実験では膨大な数の分子を扱う場合が多いので、デジタルPCR等の特殊な実験を除けば統計学的な意味でのサンプリングエラーは無視できると思っています。分散の多くはそれ以外のステップに由来するでしょう。個人的にはCt値のプラスマイナス1を同じ程度のバラつきと考えるほうが自然に思います。そのほうがRQが大きく異なるサンプル間でも分散をほぼ一定として扱える。実際にはCt値が大きくなればCt値で考えた分散でさえも大きくなるので、対数変換のみでは追いつかない訳ですが。

(無題) 削除/引用 No.9463-9 - 2021/02/01 (月) 10:17:10 - おお >[Re:8] sさんは書きました : > いつも思ってるんだけど、正規分布してるのはΔCtであって、2^ΔCtは対数正規分布じゃないのだろうか。 > したがって正規分布を仮定する何らかの統計検定をするなら、2^ΔCtではなくてΔCtに対してする必要があるのでは。 たとえばチューブに１００コピーに相当するサンプルのボリュームをPCRチューブに入れたとして複数のチューブを用意してた場合は、入っているコピー数の平均は１００で、それぞれのチューブのコピー数をプロットすると正規分布にしたがう。そのチューブそれぞれのCt値はの分布はコピー数の分布を対数変換したもの。だから２＾（ーCt）などを使うほうが私はいいのではないかとおもう。非常に幅のある分布で考えればたとえばチューブで８コピーの割合で入るなら、正規分布で４コピー入るチューブの数（確率）と１２コピー入るチューブの数（確率）は一緒になるが８コピーのときのCtをCt(m)とすると、４コピーのときのCt値はCt(m)＋１、１２コピーのときはCt(m)ー０.５８。左右対称性が失われて正規分布でないことがわかる。 ただしCt値のブレの範囲で直線的とみなせるという見方もありかとおもうし、ΔCtなどを使い統計処理している人も多いと思う。

(無題) 削除/引用 No.9463-8 - 2021/02/01 (月) 09:32:10 - s いつも思ってるんだけど、正規分布してるのはΔCtであって、2^ΔCtは対数正規分布じゃないのだろうか。 したがって正規分布を仮定する何らかの統計検定をするなら、2^ΔCtではなくてΔCtに対してする必要があるのでは。 今の話で言うと、基準になるサンプルAは、平均値が1ではなく0になると思う。

(無題) 削除/引用 No.9463-6 - 2021/02/01 (月) 03:29:28 - おお >サンプルAがサンプルB,C,Dと同じ状態？の値がある時点（ΔCT値）でなら、Dunnett'sが可能だということで合っていますか？ あ、そういうことでした。あるいは２＾（ーdCT)をつかうか。 もう一つはAのdCTの平均をとっておけば、その値からAの各サンプルを含め各サンプルのddCTおよび２＾ーddCTが算出できますね。 このような状態ならAの各サンプルの相対値を反映することができるのでDunnett'sは使えます。 >多重検定補正として、Bonferroniを考えています。 Bonferroni Holm-Bonferroni （Holm Step Down) Šidák correction などがあります。これらなら正攻法といえると思いますが、後者２つは統計に関心がないしとは知らないかもしれません。なので知らない人からツッコミが入るとか、共同でやったり昔のデーターがBonferroni でやっていて論文全体でばらばらになってしまうとか、ボスが知らないので使う踏ん切りがつかず、Bonferroniにしなさいといってしまうとかいう弊害はもしかしたらあるかもしれません。そういう意味でめんどくさいのでわたしはBonferroniで統一するようにしています。

(無題) 削除/引用 No.9463-5 - 2021/01/31 (日) 18:33:31 - yyii qq様 ご質問ありがとうございます。説明不足申し訳ありません。 サンプルA,B,C,Dは、別々の条件の試料です。それぞれ３つずつ用意してqPCRを行いました。 それぞれ１つずつ用意して複数回PCR、だとただのPCRの手技確認になってしまうと思っています。 今回調べたい遺伝子が、条件の変化により変動するかを知りたいです。

(無題) 削除/引用 No.9463-4 - 2021/01/31 (日) 18:26:12 - qq サンプルA,B,C,Dは、別々の条件の試料で、それぞれ1つづつしかないのだけど、それを複数回のqPCRをかけたということでよろしいんでしょうか？ あまりオススメでない。

(無題) 削除/引用 No.9463-3 - 2021/01/31 (日) 18:14:20 - yyii おお様 ご回答ありがとうございます。とても勉強になります。 ΔΔCT値が（サンプルBのΔCT値）−（サンプルAのΔCT値）の値なので、サンプルAのΔΔCT値がありません。 ΔCT値でしたらサンプルAの値があります。 （今回、私の実験で出しましたΔCT値は、サンプルごとの、ターゲット遺伝子ｘとハウスキーピング遺伝子のCT値の差分です。） サンプルAがサンプルB,C,Dと同じ状態？の値がある時点（ΔCT値）でなら、Dunnett'sが可能だということで合っていますか？ また、上記でもやっぱりDunnett'sは不適応だった場合、 もうひとつご提案いただいたOne sample T testあるいはPaired T test後の多重検定補正として、Bonferroniを考えています。 これよりも良いものがありますか？

(無題) 削除/引用 No.9463-2 - 2021/01/31 (日) 17:19:38 - おお サンプルAの２^(-ΔΔCT値)が３つありますよね。その平均をとってそれを１とすれば、平均値１に対してそれぞれのサンプルAの値がでます。この状態ならDunnett's testを適用してもいいです。 それが何らかの理由でできないと言うなら、サンプルAの１に対してOne sample T testをする手があります。今回の場合は多重検定補正が必要です。 実験のデザインからして一回目の実験のサンプルA、B、C、Dをペアーに２回目、３回目もどうようにできるというような場合はPaired T testの適応も選択肢でしょう。この場合も多重検定補正が必要です。 質問に書かれたような方法ではDunnett's testはだめだと思います。

相対値を算出してからの多重検定はありですか？ 削除/引用 No.9463-1 - 2021/01/31 (日) 16:56:51 - yyii リアルタイムPCRをして、サンプルAの２^(-ΔΔCT値)を１として、サンプルB,C,Dの相対値を出しました。リアルタイムPCRを3回行いました。 このサンプルAと比べて有意差があるか調べたいとき、Dunnett's testをするのは統計的に可能なのでしょうか？ サンプルAは１という値しかありません。サンプルAの値の分散はサンプルB,C,Dの値の分散とは違うのに、AvsB　AvsC AvsDをして差が出るのは当然だと感じてしまいます。 このようなときどういう統計解析を行うのがベストなのか知りたいです。

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