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(無題) 削除/引用 No.9450-8 - 2021/01/27 (水) 13:08:15 - AA vivoの話になるので的外れかもしれませんが、 神経細胞の興奮マーカーとしてよく使われるc-fos遺伝子座にCreERT2を入れたマウスで、 ・開始コドン部位にCreER-pAでいれたもの ・STOP部位に2A-CreERでbicistronicにいれpAは内在配列を使ったもの の2種類を同じラボが作成し、後者のほうがより内在性発現に近い結果になっているというような結論でした。 (それぞれ単独の論文になっていて前者も使えないわけではないです) 開始コドン部位に入れていて質問者さんのケースと単純に比較はできませんが、 pA配列が変わってしまうことによる発現レベルでの変化というのは十分ありえます。 ノックイン細胞作成については、手持ちのツールによる制限も大きいと思いますが、個人的にはCas9 RNP＋一本鎖DNAドナーでエレクトロポレーションするのが最も効率的だと思っています

(無題) 削除/引用 No.9450-7 - 2021/01/27 (水) 05:13:42 - おお >[Re:1] KIさんは書きました : > > 5'-----gene X-----stop----3'というゲノム構造のところへ、タグを挿入する場合、論文により2パターン少なくともありました。以下がそのノックイン後のゲノム構造です。 > > 場合1： > 5'-----gene X-----"flag"-stop----3' > > 場合2： > 5'-----gene X-----"flag-stop-pA----"stop----3' > 参考にした論文を教えていただけませんか？それぞれ目的があってのことかと思いますので。 ２はなんとなくC-末FLAGタグ発現ベクターを利用してKnock in コンストラクトを作ったのかもしれない。 flag-stopの部分でスプライシングが起こりやすくなった場合、flag-stopの途中で下流にエクソンにつながってしまうスプライシングプロダクトができてしまうだろうから直後で転写を停止してしまったほうが安心ではある。

(無題) 削除/引用 No.9450-6 - 2021/01/26 (火) 17:01:00 - KI ii様 ありがとうございます。 確かに発光顕微鏡があるかどうかをまず調べるべきですね。盲点でした。

(無題) 削除/引用 No.9450-5 - 2021/01/26 (火) 12:09:32 - ii 僕は狙った位置に配列をノックインしたことはないので、その方法に関してはよくわからないです。 Nanolucはプレートリーダーを使うと非常に高感度に検出できるのですが、発光顕微鏡を持っている施設が少ない関係上、生きている細胞中で発光の局在を追うような実験がなかなかできないという制約があります。

(無題) 削除/引用 No.9450-4 - 2021/01/26 (火) 05:06:25 - KI ii様　そば様 ありがとうございます。 なるほど、そういう意味合いがあったのですね。 いずれにしろデザインにどちらかが誤りだというわけではないことがわかりました。 局在を見るのならNanolucやcloverでもいいかもしれませんね。 ありがとうございました。 もしこのトピックをご覧になっていただいていたらでいいのですが、 ii様やそば様はノックイン方法として何を用いられていますか？ 私は500bpのホモロジーアームを両端に持たせたドナープラスミドと、gRNAを入れたpx330をこトランスフェクションしています。 もし可能でしたらご意見をいただけますと幸いです。

(無題) 削除/引用 No.9450-3 - 2021/01/25 (月) 09:25:38 - そば その2つでは3' UTRが異なるということでしょうから、発現制御がmRNAレベルで行われている時 (たとえばmiRNAによる制御など) は発現量が変わってくると思われます。

(無題) 削除/引用 No.9450-2 - 2021/01/25 (月) 08:33:13 - ii stop codon後にRNAの安定性とか局在に関する配列が有ることもあるので、不用意にpoly Aシグナルを新規に入れると、本来の発現パターンを反映している保証が無くなるかもしれません。 あとゴルジ体局在シグナルはC末に有るらしいので、タグ後にその配列が来るようにする工夫が必要かもしれません。 自分としては、(実験の目的次第ですが) FLAGタグを入れてわざわざ抗体で検出するくらいなら、Nanolucか何かを入れちゃうのもアリなのではと思います。

タンパク質のC末にタグを挿入することに関して 削除/引用 No.9450-1 - 2021/01/25 (月) 05:27:28 - KI お世話になります。 トピックを立てさせていただきます。ご意見いただけますと幸いです。 私が着目するタンパク質はある細胞にて発現量が非常に低く、抗体では検出できません。 プラスミドによる過剰発現では抗体はきちんとウエスタンブロットにてバンドを示すので、発現量の問題と考えています。ゴルジ体膜に局在するため、オルガネラの分画化を行いましたが、それでも検出できませんでした。 そこでCRISPR-Cas9を利用して当該遺伝子のストップコドン前にFlagタグを挿入したいと考えていますが、この時のお作法について調べていますが、論文により様々なのでここで質問させていただきたいです。 5'-----gene X-----stop----3'というゲノム構造のところへ、タグを挿入する場合、論文により2パターン少なくともありました。以下がそのノックイン後のゲノム構造です。 場合1： 5'-----gene X-----"flag"-stop----3' 場合2： 5'-----gene X-----"flag-stop-pA----"stop----3' 二重引用符で囲った部分がゲノムに挿入されたところです。 この二つではノックイン効率や発現効率等に違いはあるでしょうか？ 二つを比較した論文が見当たらなかったため、お聞きしたいです。 また、比較はわからなくとも、どちらかの方法でうまくいっている、という方がいらっしゃいましたご意見をいただけないでしょうか？ ノックインは初めてでまだ勉強中ですが、どうぞよろしくお願いいたします。

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