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(無題) 削除/引用 No.9447-19 - 2021/01/25 (月) 12:41:37 - GI35 ブロット用メンブレンや、各種レジンなどと同様、チューブ表面の吸着にもキャパシティーというものがあります。 同じ液量で同じ面積だけチューブに接触するとすると、DNA量が吸着キャパを大きく上回るほど、吸着ロスのインパクトは小さくなります。逆に吸着キャパに近い、あるいは吸着キャパがDNA量を上回るような、微量のDNAは、入れた量のほとんどをロスするということになります。 >ちなみにどのくらいのDNA/RNA濃度になると吸着が気になるみたいな目安をご存知だったりされます？ 実際には、核酸量が多くてもインパクトが小さくて影響が見えにくいだけで吸着ロスは起こっているわけですし、希釈列を作るときなんかに、濃度が高いときと低いときで溶媒を変えるのは非合理的ですので、 そういう定量的な実験をするときは、濃度に関わらずキャリア入りの溶媒を使うようにしています。

(無題) 削除/引用 No.9447-18 - 2021/01/25 (月) 11:46:49 - GI35 こういう製品があるくらいだから、微量核酸の吸着ロスは普遍的な問題なのでしょう。 https://catalog.takara-bio.co.jp/product/basic_info.php?unitid=U100004894 昔、吸着ロスによるバイアスを防止する方法を検討した論文を見たことがあります（さっき探してみたけれど、見つけられませんでした）それは鋳型DNAではなくて、qRT-PCRを行う際のRNAの希釈を取り扱っていたと思いますが、問題の根っこは同じことですね。 たしか、希釈液にlinear polyacrylamideをキャリアとして添加する方法を推奨していました。他にglycogenやtRNAかなにかも試していて、一定の効果があったと思います。 salmon sperm DNAは、多分、molecular biologyの実験書にはキャリアー剤として必ず載っている定番の試薬です。昔はherring sperm DNA（ニシン精子DNA)が普通だ、ったのですが、あれからニシンはどこへ行ったやらー、で獲れなくなったからでしょうかね、いつのまにかサケにとってかわられました。 ただし、PCRの時代になって生物由来材料を使ったglycogen、sperm DNAやyeast tRNAみたいのは、想定外の副産物が増幅される危険性があるため、敬遠されるようになってきているようです。

(無題) 削除/引用 No.9447-17 - 2021/01/25 (月) 10:34:03 - noname >[Re:15] iiさんは書きました : > ちなみにどのくらいのDNA/RNA濃度になると吸着が気になるみたいな目安をご存知だったりされます？ 私のところではコピー数で表すことが多いのですが、 20コピー以下程度からCt値に差が出始めることがおおいです。 plasmid、genome、RNAなどテンプレートの長さによるので濃度については一概には言えませんが。。。

(無題) 削除/引用 No.9447-16 - 2021/01/23 (土) 23:06:46 - 太郎 100 molecule per micro liter ぐらいから下は、何らかの対策をしないと安定的に定量することが難しいというのが当方の経験上感じていることです。

(無題) 削除/引用 No.9447-15 - 2021/01/23 (土) 09:47:18 - ii ちなみにどのくらいのDNA/RNA濃度になると吸着が気になるみたいな目安をご存知だったりされます？

(無題) 削除/引用 No.9447-14 - 2021/01/23 (土) 07:43:02 - おお >[Re:10] iiさんは書きました : > 横入りで質問したいのですが、RNAの吸着を抑え、かつPCRに干渉しない溶質って何がいいでしょう？ > tRNAを挙げられていますが、それほどどこのラボにも有るような試薬ではない気がするので、もっと一般的なもので何か有ると嬉しいんじゃないでしょうか。 RT-PCRをしているならRTしてないTotal RNAとかあると思うけど。コンタミしているgDNAなどが気になるなら種をかえるといいでしょう。哺乳動物でやっているなら、大腸菌を増やしてRNAをとってもいいわけだし。 >>サケ精子DNA >ほえーこんなの有るのか。知らなかった。 >ありがとうございます。 ノーザンブロットやサザンブロットがよくやられていたときは、ブロッキング用によく使われました。

(無題) 削除/引用 No.9447-13 - 2021/01/23 (土) 05:43:25 - ii >サケ精子DNA ほえーこんなの有るのか。知らなかった。 ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.9447-12 - 2021/01/23 (土) 00:23:23 - そば 2連でやってCt値に4も差が出るのなら、いくらテンプレートが少ないとはいえ手技的な問題も大きそうな気もしますが、、、 個人的な経験としてはCt値が30代後半を超えてくるとかなり定量性が落ちるように感じています。 他の方もおっしゃっているようにPCRへのテンプレート (cDNAでしょうか？) の持ち込み量をなるべく増やすと良いです。逆転写の際のRNA量を許容量ギリギリまで増やすとか。 もしrRNAも一緒に逆転写しているようであればrRNAを除去することを考えてもいいかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.9447-11 - 2021/01/22 (金) 17:14:31 - noname サンプルがcDNAという部分を見落としていました。 DNAサンプルの希釈には昔からサケ精子DNAが用いられることが多いですね。 DNAでも低濃度域になるとチューブへの吸着がかなり影響するので 検出系にかまないDNAを入れるのは効果的です。 PCR試薬はTritonのような界面活性剤を入れると阻害がかかるのでお勧めしないですね。

(無題) 削除/引用 No.9447-10 - 2021/01/22 (金) 17:06:24 - ii 横入りで質問したいのですが、RNAの吸着を抑え、かつPCRに干渉しない溶質って何がいいでしょう？ tRNAを挙げられていますが、それほどどこのラボにも有るような試薬ではない気がするので、もっと一般的なもので何か有ると嬉しいんじゃないでしょうか。 薄いリン酸とtritonとかでいいのかな？

(無題) 削除/引用 No.9447-9 - 2021/01/22 (金) 14:09:54 - ふお noname様 ご返信ありがとうございます。 > 後は↓みたいなのをサンプルの希釈に使うとか。 > ttps://www.nippongene.com/siyaku/product/qpcr/rtmate/rtmate.html > TEとかD.W.で希釈するのとでは低濃度域で顕著に差がでます。 現在DNAを鋳型にしていますが効果あるのでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.9447-8 - 2021/01/22 (金) 14:04:42 - ふお seventh 様 返信ありがとうございます。 > 検量線の引ける範囲＝定量可能範囲です。 確かにその通りですね。 グラフなどを作成する際に、正常に検量線を描ける範囲から外れた値は皆さんどのように表しているのでしょうか？N.D.というわけではないですよね・・・ > 実験的な解決方法としては > 単純に投入するcDNAを増やす（過剰だと逆転写反応液の持ち込みの影響等がでるかも） > おおさんの言われているように吸着によるばらつきを減らす ありがとうございます。いろいろ試してみます。

(無題) 削除/引用 No.9447-7 - 2021/01/22 (金) 13:55:07 - おお >Ct値30前後で出て、おっしゃる通り低濃度になるにつれひどくなり、少なくともCt値で4ぐらいの差 それぐらいの開きが出るにはちょっとサイクル数が早いかなって気がします。やはり吸着などでロスがあるんじゃなかろうか。

(無題) 削除/引用 No.9447-6 - 2021/01/22 (金) 13:52:00 - おお >[Re:3] ふおさんは書きました : > > すみません、２＾ーCtにすると気にならなくなるというのはどういうことでしょうか。 > > たとえばPCRチューブに平均３コピー入るぐらいの濃度だったとします。 あるときはそのチューブに１コピー、またあるときはそのチューブに５コピーはいるというのは確率としてありえます。 一方１００コピーぐらいはいる濃度であったとき、９５コピーとか１０５コピーとか入るかもしれません。 ２＾ーCtは相対的な量を示します。ですから あるときはそのチューブに１コピー、またあるときはそのチューブに５コピーという場合は ａ＊（３プラスマイナス２） ９５コピーとか１０５コピーとか入るという場合は ａ＊（１００プラスマイナス５） ａは絶対量が出ると限りないので相対的な量だった場合の係数。 ３プラスマイナス２の場合Ct値では１以上の開きがあるけど、コピー数では４コピーの中に収まる。これは１００プラスマイナス５のばあいの１０コピーの開きより小さい。

(無題) 削除/引用 No.9447-5 - 2021/01/22 (金) 13:41:05 - noname 他の方も言っているように低吸着のチューブを使うのはありだと思います。 後は↓みたいなのをサンプルの希釈に使うとか。 ttps://www.nippongene.com/siyaku/product/qpcr/rtmate/rtmate.html TEとかD.W.で希釈するのとでは低濃度域で顕著に差がでます。 ちなみにですがリコーがこんなのを出しています↓ ttps://industry.ricoh.com/healthcare/biomedical/standard-dna/infection 手技によるばらつきなのか検出系の特性なのか検証したい時は 利用するのもありかと思います。

(無題) 削除/引用 No.9447-4 - 2021/01/22 (金) 12:07:22 - seventh 検量線の引ける範囲＝定量可能範囲です。 それ以下の値に関してはすべて定量下限以下として数値の比較としては使えません。デルタCtなども増幅効率が一定であることを想定しているので。 一方が検量線範囲で一方が定量下限以下なら発現量の低下が見られるということは言えますがfold change等の定量値としては使えません。 実験的な解決方法としては 単純に投入するcDNAを増やす（過剰だと逆転写反応液の持ち込みの影響等がでるかも） おおさんの言われているように吸着によるばらつきを減らす とかですかね、

(無題) 削除/引用 No.9447-3 - 2021/01/22 (金) 10:31:34 - ふお おお様 返信ありがとうございます。 > 実際に出てくるCt値はどれくらいで、ブレはどの程度なんでしょうか。１コピーに近くなるほどブレが大きくなります。 すみません、今手元にデータがなく正確ではないですが、Ct値30前後で出て、おっしゃる通り低濃度になるにつれひどくなり、少なくともCt値で4ぐらいの差はあったと思います。 > ２＾ーCtにすると比較するときの誤差は場合によっては気にならなくなると思います。 すみません、２＾ーCtにすると気にならなくなるというのはどういうことでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.9447-2 - 2021/01/22 (金) 10:18:44 - おお 実際に出てくるCt値はどれくらいで、ブレはどの程度なんでしょうか。１コピーに近くなるほどブレが大きくなります。 ２＾ーCtにすると比較するときの誤差は場合によっては気にならなくなると思います。 あとは低吸着性のものを使うとか、場合によってはtRNAなどを一定量加えてサンプルの吸着を防ぐとかでしょうけど、その手のことは実際によく実験している人の工夫を聞くほうがあてになるかもしれません。

低濃度サンプルのqPCRについて 削除/引用 No.9447-1 - 2021/01/22 (金) 09:21:18 - ふお 低濃度サンプルをqPCRすると、レプリケート間でかなり結果がブレますよね。検量線もまともに引けず困っています。 皆さんどのように対処しているのでしょうか。 何か改善策を講じているのか、信頼度の低い検量線やサンプルのCt値を使って強引に解析するのか・・・お教えいただけないでしょうか。 ちなみに今私が行っているのはプローブ法で、検量線を用いた解析です。 よろしくお願いいたします。

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