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THP-1 macrophage トピック削除
No.9441-TOPIC - 2021/01/20 (水) 02:41:08 - 真夜中の貴公子II
THP-1をPMAで刺激してマクロファージ様細胞として刺激する実験を久々にやっています。そのことで質問です。あまりにも昔過ぎて、以前どうやっていたか詳しく覚えていません。どなたかご教授願います。

THP-1をRPMI中、PMA(10-100 ng/mL)で24-48時間刺激しマクロファージ様にして、その後、TLRリガンドや活性を見たい低分子化合物や薬剤で刺激しています。最終的なリードアウトはサイトカイン（TNF-a, IL-1b, IL-6, IL-12, IL-10など）のreal-time PCRやELISA、またはフローでの活性化レベルの評価です。
残っていたノートや記憶を辿って系を作ってみたのですが、PMA刺激後すぐにリガンドなどで叩くと、ベースラインが相当上がっているのか、LPS刺激下でさ
えサイトカイン産生がvehicleと比較して1.5 fold程度しか上がりません。
以前はもっと上がっていたはずで、ちょっと思い出したのはPMA刺激後に更に24-48時間RPMI中で培養して一旦リセットような気がしました。
これも試してみたのですが、RPMIに戻した後の刺激では、細胞がすぐにはがれてきてしまいました。サイトカイン産生も思ったほど上がっていませんで、LPS刺激で1.5 foldくらいのままでした。
この系について以下の質問です。

1. PMA刺激後のリセット（コンディショニング）は必要か？
2. リセット後はどうしても細胞は脆弱になりはがれやすくなったりするのか？
3. VehicleとLPS等のリガンド刺激（試験物質）でのサイトカイン産生で差を広げるためにはPMA濃度と処理時間他、どんな方法が最適なのか？

これらについて、何か情報や知見をお持ちの方がいたら、教えていただけますでしょうか。

個人的にはTHP-1は一癖ある細胞、と思っていますし、あくまでも純なマクロファージとは言えないことは十分承知の上で、パイロットスタディー的にやっています。
これでうまくいけば、PBMCからのマクロファージ分化系やバイオプシーからの単離でやる予定でいます。いきなりそうはいかないので、できればTHP-1で何らかの安定した結果が欲しいです。

宜しくお願いします。
　
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(無題) 削除/引用
No.9441-3 - 2021/01/22 (金) 08:45:01 - 真夜中の貴公子II
おおさん

どうもありがとうございます。
私の方でもそこに出ている論文にたどり着いていました。
PMA刺激後にコンディショニングするかどうかはその後の目的によるようなところもありますね。
また、他の論文ではRPMIに戻してコンディショニングを5日まで伸ばして検討していますが、それによると、コンディショニングの日数が長くなるほどLPS等への応答性は下がるようです。
これらからとりあえず系を決めましたが、PMA 48h後に、そのまま使用と24 hコンディショニングで比較してみたいと思います。

(無題) 削除/引用
No.9441-2 - 2021/01/22 (金) 08:06:56 - おお
経験があっての話でなく論文を探してみただけで論文を読んだ上での質問だとあまり参考にならないかもしれませんが、時間も立ってるし、、、
PMID: 17334670
For the LPS or Ab1-42treatments, the macrophages differentiated with 5 ng/ml PMA were washed with PBS and incubated in 2 ml of serum free RPMI 1640 for 3 h. The macrophages were then treated with ...


https://www.researchgate.net/post/Which_conditions_do_I_need_to_differentiate_to_THP-1_cell_to_macrophages
ここのDiscussionではPMA除いてから１日とか置くのが大抵のようだと指摘してますね。


PMID: 26826276
この論文ではいろいろな条件を試してますね。
細胞がどの程度剥がれないで接着しているかなども調べている。

PMAのぞいてしばらく培養したほうがいいように思えます。培地交換してもいくらかPMAが残っている可能性を考えて交換時によく洗うとか。アッセイを開始するまで毎日培地を交換するとかすれば改善するかもと机上の空論レベルで思いました。

THP-1 macrophage 削除/引用
No.9441-1 - 2021/01/20 (水) 02:41:08 - 真夜中の貴公子II
THP-1をPMAで刺激してマクロファージ様細胞として刺激する実験を久々にやっています。そのことで質問です。あまりにも昔過ぎて、以前どうやっていたか詳しく覚えていません。どなたかご教授願います。

THP-1をRPMI中、PMA(10-100 ng/mL)で24-48時間刺激しマクロファージ様にして、その後、TLRリガンドや活性を見たい低分子化合物や薬剤で刺激しています。最終的なリードアウトはサイトカイン（TNF-a, IL-1b, IL-6, IL-12, IL-10など）のreal-time PCRやELISA、またはフローでの活性化レベルの評価です。
残っていたノートや記憶を辿って系を作ってみたのですが、PMA刺激後すぐにリガンドなどで叩くと、ベースラインが相当上がっているのか、LPS刺激下でさ
えサイトカイン産生がvehicleと比較して1.5 fold程度しか上がりません。
以前はもっと上がっていたはずで、ちょっと思い出したのはPMA刺激後に更に24-48時間RPMI中で培養して一旦リセットような気がしました。
これも試してみたのですが、RPMIに戻した後の刺激では、細胞がすぐにはがれてきてしまいました。サイトカイン産生も思ったほど上がっていませんで、LPS刺激で1.5 foldくらいのままでした。
この系について以下の質問です。

1. PMA刺激後のリセット（コンディショニング）は必要か？
2. リセット後はどうしても細胞は脆弱になりはがれやすくなったりするのか？
3. VehicleとLPS等のリガンド刺激（試験物質）でのサイトカイン産生で差を広げるためにはPMA濃度と処理時間他、どんな方法が最適なのか？

これらについて、何か情報や知見をお持ちの方がいたら、教えていただけますでしょうか。

個人的にはTHP-1は一癖ある細胞、と思っていますし、あくまでも純なマクロファージとは言えないことは十分承知の上で、パイロットスタディー的にやっています。
これでうまくいけば、PBMCからのマクロファージ分化系やバイオプシーからの単離でやる予定でいます。いきなりそうはいかないので、できればTHP-1で何らかの安定した結果が欲しいです。

宜しくお願いします。
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