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さまざまな回答ありがとうございます。 削除/引用 No.944-9 - 2012/09/22 (土) 00:40:23 - HK 　さまざまな返答ありがとうございます。 　固定法は基本的にはPFAで行っているんですが、アセトン固定やエタノール固定、未固定も試してみました。 　染まり方はあまりPFAと変わらず、組織が委縮して全体に見づらくなったためPFAが無難な印象です。 　PBSにTweenも混ぜており、希釈液はTritonを混入したものも試してみましたがあまり変化なく、ごみが増えて見づらくなってしまったため市販の抗体希釈液(Dako REAL™ Antibody Diluent)を使用しています。 　抗体の濃度を上げたりもしてみたのですがいまひとつです。 　組織は以前、このタンパクの発現が増加するという報告をしている論文と同じようにラットに処置をして、同じ時期に組織を回収しているので染色されるはずなのです。。。 　これでうまく染まるようになれば、私の実験している組織を染色したいと思っているんですが。 　量があまりたくさんとれない小さい組織でMicrodisectionをおこなって採取する必要があるためWestern blotは難しいみたいです。（私はまだ試したことがありません。） 細胞質が染まっている可能性はあるかもしれません。 もう少し、文献を探して細胞質が染まることもあるものなのか調べてみます！！

(無題) 削除/引用 No.944-8 - 2012/09/21 (金) 15:40:04 - おお >[Re:7] taraさんは書きました : > 核内に抗体があまり入っていないのでは？ > 膜透過を上げてみては？（saponinとかtweenとか） > >[Re:1] HKさんは書きました : > 　固定法を変えたり、抗体の濃度を変えたり、Blockingの時間を長くしたりいろいろ試しましたが毎回同じように染色されます。 ちなみに固定法は具体的に何を試しましたか?それによって抗体がうまく核にアクセスしてないかの判断とかもちょっと変わってくるかもしれません。 抗体希釈液にが何かも気になるところですよね。デタージェントが入っていたかどうか、、、最近のプロトコールは0.1%ぐらいのTRITONXー100を入れるのが多く見られるのですが、、、

(無題) 削除/引用 No.944-7 - 2012/09/21 (金) 11:35:33 - tara 核内に抗体があまり入っていないのでは？ 膜透過を上げてみては？（saponinとかtweenとか）

(無題) 削除/引用 No.944-6 - 2012/09/21 (金) 00:00:15 - お 細胞質にシグナルが出ていると思います。 一度、蛍光ではなくDAB等の化学発色＋カウンターステインを行い確認するか、細胞質へ染まる抗体とマージさせてもよいかもしれません。 抗体の非特異反応でないことを祈りたいですが、なかなか悩まされるところですね。今までどれほどの大金を、San◯a　C◯◯に叩いたことか。。。 メーカーによっても、ハズレが多いところ、あたりが多いところ色々ですので、噂は案外、大事かなと思っていたりします。 おおさんの仰るように、コントロールをきちんと置いておけば問題ないかと思います。 WBで発現量のデータを出してあれば、なお良いかと思います。

(無題) 削除/引用 No.944-5 - 2012/09/20 (木) 01:57:30 - おお あなたの細胞では主に細胞質で発現するということではないのでしょうか。なにかノンスペを否定するコントロールをおくといいかもしれません。 くわえて論文や、核がそまる細胞で、実際に同じイメージになるか、核が染まる細胞株があるかチェックすれば、実験じたいに信用せいがでてくるのでは?

解答ありがとうございます。 削除/引用 No.944-4 - 2012/09/19 (水) 19:42:52 - HK 　さっそくの解答ありがとうございました。返答が遅くてすみません。 　抗体はモノクローナル抗体で商業的なものです。 　その抗体を使用してきれいに染まっている論文もあるので抗体の問題は少ないと思います。 　先輩に一度染色してもらったこともあるのですが、やはり同じように少しずれた形で染色されました。 　核と核の間を狙ったように抗体が染色されます。 　2個核が並んでいたら、その部分をさけて(核の部分だけ色が抜けて)ちょうど2核の好酸球のような形に周りをとりかこんで染まったりします。 　顕微鏡はシーメンスの蛍光のもので手動ではなく波長の切り替えや撮影まで全てパソコン操作で行うものなのでずれることはあまりないと思います。 　実際、同じ組織を別の染色してみると特に大きなずれはみられないです。 　(細胞質の染色ですが。) 　コントロールと比較して行っているのですが、発現が増加していると予測される組織ではずれることが多く、コントロールの方がMergeしているものが多いです。 　発現量が多くてHoechstが染まりにくくなることもありますか？？ 　抗体を別の会社のものに変えるのも考えているのですが、値段のことやまた失敗する可能性を考えるとなかなか踏み切れません。

(無題) 削除/引用 No.944-3 - 2012/09/19 (水) 00:42:39 - おお >Mergeしないとのことですが、顕微鏡の操作中にスライドの位置がずれているということはないでしょうか？ イメージを見てみないとなんともいえませんが、私も上の可能性とか疑ってしまいます。DAPIなどでイメージをとって、つぎに目的のものをみて、もう一度DAPIにもどして、DAPIの染色の位置がずれてないかみてみてはどうでしょうか。 DAPIなどの染色は核内でも強く染まるところと弱く染まるところがあり、そのパターンに一致していないと言う事なら別に変なことではないと思います。他の核タンパクは見ましたでしょうか?

(無題) 削除/引用 No.944-2 - 2012/09/18 (火) 23:34:12 - お 使用している抗体は各内蛋白用の抗体ですか？ポリクローナルですか？モノクローナルですか？ 実際に商業ベースに出ているものでしょうか？ Perinuclearに染まる抗体というものも存在します。 封入剤はどのようなものを使われていますか？ 観察は共焦点ですか？蛍光顕微鏡ですか？ Mergeしないとのことですが、顕微鏡の操作中にスライドの位置がずれているということはないでしょうか？ 質問者さんの場合、実験初心者とのことですので、蛍光漏れや組織のアーチファクトも気になるところです。 そもそもの切片が崩れていたら(初心者の切片は挫滅が大きいですし。。。)、いくら免染しても変なところにシグナルが出ます。 本人がきちんとしているつもりでもぐちゃぐちゃの切片を見ているという初心者は多いです。(ひどいラボになると論文にまで平気でぐちゃぐちゃな切片を出している人もいるくらいで。。。) 一度、ラボ内の先輩か先生に見てもらうほうがよいかと思います。

核内タンパクの染色について 削除/引用 No.944-1 - 2012/09/18 (火) 23:09:25 - HK 　実験初心者のものです。 　現在、凍結標本の薄切切片の免染を行っているのですが、核内タンパクがうまく染まらず、HoechstとMergeしない状態で足踏みしています。 　核のような形で染色されているのですが、Hoechstとは少し位置がずれてしまいます。 　(すぐ横が染まったり、ちょうどジグソーパズルのようにHoechstが染まらない場所に合わせた形でそまったり) 　基本的なプロトコールとしては4%PFAで固定してBlocking(30分)、１次抗体(4℃overnight)、二次抗体(Room temperature 1h)、Hoechst、封入といった感じです。 　固定法を変えたり、抗体の濃度を変えたり、Blockingの時間を長くしたりいろいろ試しましたが毎回同じように染色されます。 　まれにきれいにMergeしていることもあるのですが、同じ条件、同じスライスでもMergeしている場合としていない場合があります。 　まったく染色されていないわけではないと思うんですが、HoechstをDAPIに変更することでうまく染色されることとかありますか？ 　同じような経験をされた方でいい解決法をご存じの方がいれば教えてください。 　お願いします。

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