全8件 ( 1 〜 8 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

(無題) 削除/引用 No.9438-8 - 2021/01/27 (水) 16:06:45 - おお >[Re:6] モルカーいいよねさんは書きました : > タンパク質一過性発現の補正ですがやはりウェスタンなどでタンパク量を測るのが一番確実でしょうか、正直ランニングコストと手間の点で及び腰ではありますが。。。 > ドットブロットやスロットブロットなら泳動の手間は省けますけど（抗体が良ければ）。 あとはELISAとか。

(無題) 削除/引用 No.9438-7 - 2021/01/27 (水) 13:02:07 - 　zsxdcfrvgTByh クリーンベンチで10分以上放置する方法は一流ラボでは標準的な方法と偉い人に言われたことあります。というか細胞撒いて、均一になるように数回振ってすみやかにインキュベーターにしまったら、あり得ないみたいなこと言われてすごく怒られました。pHの変化とか温度とかのことを言ったのですが、関係ない話と一蹴されました。きっと一流のラボはベンチ内でもpHが変化しないHEPES含有の培地で、かつ温度の影響を受けにくい細胞を使用していて、室温で接着が促進するような特殊な培養器材を使ってるのかもしれないと思いました。私はそうしたラボの出身でも在籍者でもないし、一流ラボの真似をしたいとも思わないのでクリンベンチに放置するようなことはやっていません。そのあと（その前も）のラボはどこも播種後はみんな普通にすみやかにインキュベーターにしまっていました。

(無題) 削除/引用 No.9438-6 - 2021/01/27 (水) 10:31:34 - モルカーいいよね 皆様ありがとうございます、 ご意見纏めさせていただくと ・細胞懸濁液はあくまで懸濁液なのでよくピペッティングして播く（塊をほぐす、濃度勾配を作らない） というのが基本かつ重要ということでしょうか。 後、ウェル内で均一に分布させる際に私はいつも播いてすぐに混ぜていたのですが、底に沈めてから振った方が偏りがなくなるのですかね、試してみます。 タンパク質一過性発現の補正ですがやはりウェスタンなどでタンパク量を測るのが一番確実でしょうか、正直ランニングコストと手間の点で及び腰ではありますが。。。

(無題) 削除/引用 No.9438-5 - 2021/01/25 (月) 12:10:14 - おお >また、GFPなど発現させていない場合の発現タンパク質活性のノーマライゼーションは細胞数で補正するので十分でしょうか。 一過性の発現をしてその細胞を使って酵素活性を測るのだと思いますが、目的のタンパク量で補正する方がエラーが少ないと思われます。

(無題) 削除/引用 No.9438-4 - 2021/01/25 (月) 10:26:54 - ど素人 細胞懸濁液は溶液やコロイドと違って確かに均一性の問題がありますが、完全な single suspension であればピペッティングなどで混ぜて播くことである程度均一になるのでないでしょうか。 細胞数がバラつく元の原因を考えると、やはり接着系細胞をトリプシン処理したときの細胞の分かれ具合があるかと思います。複数の細胞がくっついた状態のもの (細胞塊) が残ると均一な播種が難しくなる気がしますので、ひとつはトリプシン処理 (あるいは他の細胞剥離処理) の充分な観察と検討・最適化は価値があるかもしれません。 細胞塊の存在をどうしても除外できない場合は、その存在を回避する方法を考えることになるかもしれません。ひとつには、何らかのメンブレンでフィルターする可能性があるかも。もうひとつは、細胞懸濁したあとに、細胞塊が恐らく single cell より沈降速度が速いであろうことを考慮して、少し時間を置いた後に上の方から液をとって播く (底に近いところからは液をとらない) ことにも効果があるかもしれません。 実験内容については詳しくは分かりませんが、阻害物質というのが細胞増殖に影響を与える場合、どの時点での細胞数にて考えるのかという問題は検討の価値はあるのかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.9438-3 - 2021/01/23 (土) 05:45:34 - おお >通常使用量の２倍程度、24 wellなら500μlの液をwellにいれた後に >クリーンベンチ内で10分程度静置をして、細胞をそこに沈めた上でインキュ >ベーターに入れています。 最近クリーンベンチなどで結構な時間放置するという方法がよく紹介されるのですが、、、 pHがアルカリにどんどん偏っているだろうし個人的には不安です。長期CO2Incubator外でpHが変わらないという培地をInvitrogenが売り出したようですが、そういうものを使っているのでしょうか。。。 ＞マイクロピペットで毎回すって入れてをしていると、細胞混濁液で徐々に細胞がチューブの外に沈んできますので時間がたつと細胞数にばらつきがでてきてしまう 毎回吸い取るときに激しくならない程度でピペッティングする（吸い出し）といいかと思いますが、、 個人的にはプレートに分注後Incubatorに数分いれて、細胞が底の方に偏ってから前後、左右に振りながら偏りをなくしてIncubatorに戻してますが、、、

(無題) 削除/引用 No.9438-2 - 2021/01/22 (金) 14:29:09 - あおい わたしが使用している方法としては、 細胞混濁液をあらかじめ準備しておき、 通常使用量の２倍程度、24 wellなら500μlの液をwellにいれた後に クリーンベンチ内で10分程度静置をして、細胞をそこに沈めた上でインキュベーターに入れています。 通常の電動ピペッターで500ulずつ、でも誤差の程度で問題ないかなと思います。 マイクロピペットで毎回すって入れてをしていると、細胞混濁液で徐々に細胞がチューブの外に沈んできますので時間がたつと細胞数にばらつきがでてきてしまう可能性があります。 実際、電動ピペッターでやった場合でもピペッティング後に細胞を吸うのが遅くなってしまった場合、ピペッターの先端に細胞がたまっているようで、最初に入れたwellに偏って細胞が多く入ってしまうというようなことがありました。 どの方法を使うにせよ、直前にきちんとピペッティングすることが重要かと思います。 阻害曲線については残念ながら知識不足ですのでお答えできません。

マルチウェルプレートへ均一な細胞数で細胞を播くには 削除/引用 No.9438-1 - 2021/01/19 (火) 16:41:36 - モルカーいいよね いつも勉強させていただいてます。 標記の通り、 「マルチウェルプレートへ均一な細胞数で細胞を播くにはどうしたら良いか」 皆様が実験する際のコツ等ご教示いただけますでしょうか。 私が行っている実験は、24ウェルプレートに細胞を播き、標的タンパク質をトランスフェクション後、様々な濃度の標的化学物質を曝露し阻害曲線を描くというものです。 現在のメソッドでは、トリプシン消化した細胞に培地を添加（総量12mL）、ピペッターで10回程度懸濁し、マイクロピペットで0.5mLずつ各ウェルに播種しています。 また、GFPなど発現させていない場合の発現タンパク質活性のノーマライゼーションは細胞数で補正するので十分でしょうか。 以上、皆様の御知恵をお借りする事ができましたら幸いです。

全8件 ( 1 〜 8 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

このトピックにメッセージを投稿する 名前  メール  　アドレス非公開    タイトル  本文       設定  クッキーを保存（次回の入力の手間を省けます） 上に上げない（トピックの一覧で一番上に移動させません） 解決（問題が解決した際にチェックしてください） 暗証  半角英数字8-12文字の暗証番号を入れると、あとで削除、修正ができます。 送信

---

〔使い方〕 「アドレス非公開」をチェックすれば、自分のメールアドレスを公開しないで他の方からメールを受け取れます。 問題が解決した際には、解決ボタンをチェックして解決した旨のコメントをつけてください。これは、初めにトピックを作った人と管理人のみが可能です。 半角カタカナ、機種依存文字(全角ローマ数字、○の中の数字等)は文字化けの原因となりますので使わないでください。

---