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(無題) 削除/引用 No.9426-10 - 2021/01/16 (土) 08:15:23 - Skeptic ピペット冷やすのは正直やり過ぎかもと思いながらやっていました。まあ、やって悪いことはないというつもりで。

(無題) 削除/引用 No.9426-9 - 2021/01/15 (金) 16:51:34 - sai Skeptic 様 ご回答ありがとうございます。 低温室で行っていたのですか。 私の大学では低温室に遠心機がないので、常に冷やして行う系で行うしかないです。 液を吸うことで、ピペットを冷やしているのですね。そのやり方でやってみようと思います。 ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.9426-8 - 2021/01/15 (金) 15:21:35 - Skeptic 可能ならば全ての作業を低温室で行っていました。そうでない場合には、例えば培養用のディスポピペットで懸濁液を吸う場合には、その前にまず氷冷した滅菌水をそのピペットで一度吸い上げて吐き出すようにして冷やしていました。

(無題) 削除/引用 No.9426-7 - 2021/01/15 (金) 14:48:07 - sai Skeptic 様 ご回答ありがとうございます。 私も培養後の操作以降冷やすということは意識していましたが、ピペットも冷やすというのは思いつきませんでした。 ピペットを冷やすというのはチップのみを冷蔵庫内等で冷やして用いるということでよろしいでしょうか。 確かにvortexでの懸濁は考えてみると大腸菌に大きなダメージが入りそうですね。次に行うときはピペッティングで懸濁してみようと思います。 ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.9426-6 - 2021/01/15 (金) 10:54:24 - Skeptic うちでは次の点に気をつけていました（最近は買ってます）。 培養の容器は良くすすいで極微量の洗剤の持ち込みにも注意する（洗った後、一度ＭＱ水で満たしてオートクレーブするという人もいました）。 培養後の操作はどの瞬間も冷やし続ける（遠心チューブに触れる場所にも気を付ける、ピペットも冷やす）。 懸濁はvortexではなくピペッティングで。

(無題) 削除/引用 No.9426-5 - 2021/01/15 (金) 10:20:51 - sai AA 様 ご回答ありがとうございます。 また、お返事が遅くなり申し訳ありません。 NEBのプロトコルを紹介して頂きありがとうございます。 確かに大雑把ですね。もう少しプロトコルを簡略化してもいいのかもしれません。 あと、LB培地ではなくSOB培地を用いていたり、おっしゃる通りWashからグリセロールを用いていたりと自分が行っているプロトコルと異なる点があるので、変更してもう一度行ってみたいと思います。 確かに慣れは重要かもしれませんね。頑張って作ってみます。 ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.9426-4 - 2021/01/15 (金) 10:16:49 - sai G25 様 ご回答ありがとうございます。 また、お返事が遅くなり申し訳ありません。 方法が丁寧すぎるということは、もう少し簡略化して凍結までの時間を短くすべきなんですかね？ また、細かいところももう一度確認して行ってみようと思います。 ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.9426-3 - 2021/01/13 (水) 15:19:10 - AA ttps://international.neb.com/protocols/2012/06/21/making-your-own-electrocompetent-cells NEBの公開プロトコルだとWashの段階から10%グリセロールのようですね。 (そして最後の懸濁はデカントで上清を捨てたときの残液のようで、大雑把なのだなと思いました。) ケミカルコンピの場合ですが、全く同じプロトコルに従っていても、慣れた人が作るか初心者が作るかで最終的な効率が全然違うことはかなりあります。 慣れによって作業が短縮されることで自然と解決されるかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.9426-2 - 2021/01/12 (火) 19:30:30 - G25 >形質転換効率が10^6 cfu/ug以下でした。 どんなヘボい調製だったとしてもelectroporationでそれじゃあ低すぎるんじゃなかろうか。 プロトコールを見る限り、手順はごくスタンダードで問題はなく、むしろ丁寧すぎるくらいだ。 菌液の調製以外に原因のある可能性はないだろうか。 ・ちゃんとワークすることのわかっている別ロットの菌液では、サイドバイサイドでやってみて問題なく高い形質転換効率だったのだろうか。 ・印加は問題なく行われただろうか（スパークしたりしなかったか？　時定数はいつもどおりだったか？）。 ・プラスミド量など勘違い、計算違いしていないか。過剰量のプラスミドで計測していないか。 ・選択薬剤の取り違え、過剰 etc. ..

エレクトロコンピテントセルの作製方法について 削除/引用 No.9426-1 - 2021/01/12 (火) 12:27:52 - sai いつもお世話になっております。 当方、DH5aのエレクトロポレーション用のコンピテントセル作製に手間取っており、プロトコルなどに問題がないかなどご教授願えないかと思い、トピックを作成させて頂きました。 一度作製したのですが、形質転換効率が10^6 cfu/ug以下でした。 ケミカルコンピはネットでよくプロトコルが書いてある一方、エレクトロコンピは操作が単純からなのか、全く見かけることができません。 よろしくお願いいたします。 それでは、プロトコルを書きます。 ・DH5aのコロニーをLB液体培地3mlに植菌して培養(37℃, 150rpm, 16h) ・培養後の菌体液1mlをLB液体培地100mlに植菌してOD600が0.6ほどになるまで培養(37℃, 150rpm) 培養時間は2〜3時間です。 ・OD600が0.6ほどになったら、培養していたフラスコを氷上で静置(10min) ・50mlチューブ×2に菌体液全量を移して、遠心(4℃, 5000rpm, 10min) ・上清を除去し、ice-cold滅菌水を加えvortexで懸濁して遠心(4℃, 5000rpm, 5min) この滅菌水でwashする操作を3回行いました。 ・3回目の遠心後の上清を除去し、20mlのice-cold 10%グリセロールを加えてvortexで懸濁後、50mlチューブを1本にまとめて遠心(4℃, 5000rpm, 10min) ・上清を除去して1mlのice-cold 10%グリセロールを加えてvortexで懸濁 ・-30℃で冷やしておいた1.5mlチューブに50ulずつ分注して液体窒素に入れることで瞬間的に凍結 ・-80℃で保存 以上になります。 なにかおかしい点などがあればご教授頂ければ幸いです。 重ねてにはなりますが、よろしくお願いいたします。

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