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(無題) 削除/引用 No.942-44 - 2017/03/15 (水) 14:12:04 - IHC? 昔、このフォーラムで見てPEI（Branched：自作）やってました （Lipofectamineを買ってもらえず、実験データを取れ、と鬼のようなことを言われたので。たぶん自作は今は特許侵害です） 液体窒素に入れて→お湯で溶かしてをずっと繰り返して短鎖化するProtocolで作ったものです 入れたのは遺伝子導入が難しいことで知られるMDCKです 細胞腫：MDCK PEIとDNAの質量比：忘れた。一般的な比を複数検討 培地：DMEM 効率：30〜50%　（最高で65%くらい） インキュ：3時間だったと思う tips：導入時（適用）に若干低浸透圧ストレスをかけると入りやすくなる （たぶん固い細胞以外には使わない方が吉？） 完全に度忘れしましたが導入時に培地はopti-MEMのようなものにし、さらに蒸留水で浸透圧を下げていました（これも条件検討して決めた割合） 細胞にStressを確実に与えているので特殊な条件でしか使えないと思いますが 入らない時は浸透圧を考えてみていいかもです

(無題) 削除/引用 No.942-43 - 2017/03/14 (火) 19:51:14 - moz 条件検討しました？ DNA/PEI複合体溶液総量は、最終的な増殖培地液量の1/20に固定して、 DNA/PEI複合体溶液を無血清培地、PBS、5% glucose（動物培養細胞なら無血清培地のみで良いですが、昆虫細胞の無血清培地組成が不明なので。Pluronic F68含有培地は不可。） DNA/PEI量比(w/w)=1:1, 1;2, 1:4, 1:6, 1:8程度 DNA量/10^6cells = 0.5, 1, 2, 4 ug 程度 毒性が問題なら、DNA/PEI複合体溶液滴下後3〜6時間で培地交換。

(無題) 削除/引用 No.942-42 - 2017/03/14 (火) 13:22:38 - カイコの素揚げ 昔のことなのでよく覚えていませんが、自作PEIを使ってカイコの細胞にトランスフェクションしていました。 効率はそこそこだったと思います。

昆虫細胞へのPEI maxの利用について 削除/引用 No.942-41 - 2017/03/14 (火) 11:04:00 - カイコ PEI maxが非常に安価だということで、所属する研究室で購入したのですが、うまくいきません。 細胞はBmN細胞（カイコの培養細胞）、培地はSFMを使っています。 文献を探っても人の細胞のものばかりなので、昆虫細胞でうまくいっている例があったら教えていただきたいです。

ありがとうございます 削除/引用 No.942-40 - 2015/03/03 (火) 10:00:52 - N Lさん、おおさん、あかねさん ありがとうございました。加熱すればよいのですね。試してみます。 昨日はとりあえず濁った状態のままトランスフェクションしてしまいました。 それでも効率が変わらないかどうかは結果が出たらご報告させて頂きます。

(無題) 削除/引用 No.942-39 - 2015/03/02 (月) 17:14:05 - あかね なるほど、実は私も凍結後の沈殿を経験したことがありましたが、放置しておりました。 感謝いたします。

(無題) 削除/引用 No.942-38 - 2015/03/02 (月) 17:07:23 - おお 新たな書き込みありがとうございます。凍結したものについての扱いについてはきいたこともなかったので助かります。

(無題) 削除/引用 No.942-37 - 2015/03/02 (月) 16:40:26 - L 自作のPEI(branched)を使っていますが、凍結ストックを溶かす時は50-60度で加熱するとクリアな溶液になります。PEIを導入する際に他のラボのプロトコールを参照しましたが、解凍時に加熱するよう記載されているものを幾つか見かけました。ご参考まで。

PEImax凍結融解後の析出 削除/引用 No.942-36 - 2015/03/02 (月) 14:44:02 - N 最近PEImax導入し、非常にトランスフェクション効率がよくて驚いています。 さて、質問させて頂きたいことがあります。 PEImaxを1mg/mlで水に溶かし、pH7.4に調整してフィルター滅菌後、一部は4℃保存、残りは-20℃に保存していました。 -20℃に保存していたものを融解させたところPEI?が析出しているようで濁っています。 最初に溶かしたときは透明で4℃保存していたものも透明です。 この濁ったPEIは問題なくトランスフェクションに使用できるのでしょうか？ このようなご経験のある方がいらっしゃいましたらアドバイス頂けるとありがたいです。 よろしくお願い致します。

(無題) 削除/引用 No.942-35 - 2013/04/21 (日) 06:51:18 - U2 非常に興味深く拝見させてもらっています。私のラボでもPEIを導入したいと思うのですが、クロロキンを入れるべきかどうか、判断がつきません（自分で試してみれば良いと言われてしまいそうですが....）。論文を少し調べてみると、エンドゾーム／ライソゾームの酸性化を抑制するBafilomycin-A1ではPEIでの遺伝子導入効率が下がるにもかかわらず、同様の作用機序のクロロキンでは導入効率のさらなる上昇が見られるとの報告があり、Biochemさんの実験結果と一致するようです。理論的にはどうも腑に落ちない（Bafilomycinとの整合性の点で）のですが、プロトンスポンジ効果がエンドソームの浸透圧（pHではなく）による現象ならば、エンドソーム酸性化阻害以外のクロロキンの作用が導入効率に影響する可能性もあり得ますね。実際にクロロキンをお使いの方で、どのくらいの濃度で入れてらっしゃるのか、伺えると有り難いと思っております。

(無題) 削除/引用 No.942-34 - 2013/04/21 (日) 02:09:01 - おお どうでしょうかねぇ。。。やったことがないので。。。HeLaでよくはいっているというラボから譲ってもらうとかというてはあるかもしれませんけど、、、

ありがとうございます 削除/引用 No.942-33 - 2013/04/21 (日) 00:35:57 - あべちゃん おおさん、あさん、 ありがとうございました。 自作PEIで、HeLaはあまり効率よくならないのですかね。

(無題) 削除/引用 No.942-32 - 2013/04/20 (土) 10:17:00 - あ そのかわりに（？）教えてほしいのですが、PEIの普及度はどれくらいなんでしょう。 私の周り（割と大きな研究所なんですが）はリポフェクションがほとんどで、それがだめな細胞はアマクサ（エレクトロポレーション）かレトロとレンチ（ウイルス）で、みたいな感じです。PEIはほとんど見かけません。リン酸カルシウムからリポフェクションに移り変わりましたけど、PEIに移行しつつあるという感じなんでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.942-31 - 2013/04/20 (土) 08:38:31 - おお あ

(無題) 削除/引用 No.942-30 - 2013/04/20 (土) 08:16:11 - あ 画面左の黄色い細胞のところにありますが。。。

(無題) 削除/引用 No.942-29 - 2013/04/20 (土) 08:02:14 - おお http://www.polyplus-transfection.com/transfection-reagents/3_high_throughput_screening/2_dna_hts/high-throughput-screening-jetpei/ jetPEIはPEIだとかってにおもっているのですが、上記のページのEfficient in a wide range of cell typesに HeLaものってますね。Cell Transfection Databaseとかいているのでそれぞれの細胞の条件のリストがありそうですが、、、どこにあるのか、、、、

HeLaでは？ 削除/引用 No.942-28 - 2013/04/19 (金) 17:50:24 - あべちゃん 293系統の細胞では10cmディッシュで 12ug DNA/36uL PEI (1ug/uL, pH7.4 by NaOH, polysciences社製 polyethylenimine Max) この条件でほとんどの293細胞に導入できていると思うのですが、HeLa細胞では、幾つか条件を振りましたが、余り上手くいっていません (30%程度）。PEIでHeLa細胞へのトランスフェクションは難しいのでしょうか？ それとも、コツとかあるのでしょうか？ よく使われる細胞で、情報が共有できるとありがたく思います。

(無題) 削除/引用 No.942-27 - 2012/11/24 (土) 05:20:08 - おお プロトンスポンジ効果 pH緩衝能が高い。 リソソームを破壊する。 と具体的なメカニズムの示唆がありますので、これに沿って議論すればいいのではないかと思います。クロロキン様作用についてはその線でよろしくお願いいたします。

(無題) 削除/引用 No.942-26 - 2012/11/24 (土) 00:29:33 - xyz 煽ってんじゃないよ。お前も同類。

(無題) 削除/引用 No.942-25 - 2012/11/23 (金) 23:33:26 - もるもろ http://www.kenkyuu2.net/cgi-biotech2012/biotechforum.cgi?mode=view;start=3;Code=1057 このトピックみて妙に納得？しました。 もう少し謙虚に人の意見に傾聴して、それからご自身の正当性をご発言なさった方がご自身も見る方にしても冷静でいられますよ。「それを言うなら、」だとか、「黙っていられない」なんて発言はこのforumに相応しくないと思いますが、それについてもまた応酬が来そうですね。続きどうぞ〜。（私はもう書き込みませんがw） >[Re:24] なでしこ組さんは書きました : > >[Re:23] もるもろさんは書きました : > > まともなトピックだったのにこの流れは残念ですね〜。 > > どちらの方を取るわけではないが、作用が無いとの決めつけは危険でしょう。 > > それを言うなら、根拠も無いのに自明だなんていうのも問題でしょう。 > 間違った知識や概念がさぞ真実のように語られるのは、真面目にちゃんとした研究をしてる側からしたら大迷惑でしかないですからね。 > そんなのを見ると黙っていられないんですよ。 > > 検索用にPEIの“プロトンスポンジ効果”というポインターまで示してるわけだから、興味がある人は調べてもらえればいいんだけどね。 > >

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