全8件 ( 1 〜 8 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

(無題) 削除/引用 No.9418-8 - 2021/01/10 (日) 12:40:17 - s 別の実験系の話になるので参考にならないかもしれませんが。 最近、リン酸化ERKのWBのデータを補う目的でkinase tranlocation reporterを使いはじめました(FRETはちょっと敷居が高い)。クローン化した培養細胞集団であっても私達の実験条件では個々に結構ばらつきがあることもわかり、WBはこれを平均している訳なので感度が低くてもしょうがないなあ、と納得しています。

(無題) 削除/引用 No.9418-7 - 2021/01/10 (日) 11:08:56 - たろー ポジコンは何をおいていましたでしょうか。そもそもGPCRで上がるシグナルが弱いのか、実験のどこか(抗体が悪いとかも含め)でリン酸化がなくなってるのかで考えることが大分違う気がします。 細胞腫にもよりますが、血清よりもTPAとかEGFみたいながっつり上がるやつでたたいたほうがポジコンとしてはよいかもしれません。もし試薬があればですが。

(無題) 削除/引用 No.9418-6 - 2021/01/09 (土) 12:51:54 - ii BSAは普通の、FA-freeじゃないものを使っています。どちらにしろ0.02 mg/mlなら入ってくる量は大したこと無いだろうし、FA-freeじゃないと薬剤が効かないとなると、さすがに生体内での有効性を主張するのに無理があるでしょと思っています。

(無題) 削除/引用 No.9418-5 - 2021/01/09 (土) 04:12:28 - YU 早速のアドバイスありがとうございます。いろいろとはっとさせられるポイントが多く、とても助かっています。後ほど試した結果をまた報告いたします。 ＞iiさま チューブへの吸着の件は薬剤が吸着する可能性を知っていながらも思い至っておりませんでした。まさに使用しているアゴニストも脂溶性が高い化合物でした。 思い返してみれば特に培地で薄めるタイミングを意識していなかったので日によっては少し早かったり遅かったりすることもあったと思います。シグナルが見えたり見えなかったりということがあったので、可能性としては高そうです。 HBSS+BSA、そして直前に薬液を準備するということを試してみたいと思います。 温度に関しても極力下げないよう気を付けます。 ちなみにBSAは培養専用やfatty acid freeなど、特別なグレードを使用されていますか？ ＞おおさま 余りウェルを無血清培地に交換せずに放置したものを回収して一緒に流したことがあります。一度はかなり強いシグナルが出て、もう一度はほぼbasalでした。あくまでも余りのウェルだったので適当にやっていたのが原因だとは思いますが、ちゃんと薬液添加のタイミングで一緒に血清刺激で見てみようと思います。

(無題) 削除/引用 No.9418-4 - 2021/01/08 (金) 10:24:34 - おお 血清刺激がポジコントして使えると思いますがやってみてはどうですか？

(無題) 削除/引用 No.9418-3 - 2021/01/08 (金) 05:55:10 - ii 水で薄める→BSA入バッファーで薄める

(無題) 削除/引用 No.9418-2 - 2021/01/08 (金) 05:53:58 - ii 僕もGPCR活性化見てますが、当日まで血清入の培地で培養、HBSS的な組成のバッファー + 0.02 mg/ml BSAで一度洗い、同じBSA入りバッファーで30分インキュベーションした後に、薬剤を加えてシグナルを見ています。 このバッファー組成だと疎水性な物質のキャリアーになるようなものが殆どないので、試験する薬剤が疎水性高めな場合は、薬剤を水で薄めるタイミングを薬剤処理開始の直前にする必要があります。そうしないと薬剤がチューブの表面に吸着されて失われます。 あと僕の使ってる細胞は温度が低いと目的のシグナル系が動いてしまうっぽい感じなので、加える液体がカルチャーの温度よりできるだけ低くならないように工夫しています。

GPCR下流のERKリン酸化の検出 削除/引用 No.9418-1 - 2021/01/08 (金) 03:03:07 - YU ウエスタンブロットでGPCR活性化後のERKリン酸化を検出する実験をしていますが、なかなかうまく行かないのでアドバイスをいただきたく、投稿いたしました。 あるGPCRのアゴニストをそのGPCRを内因性に発現している細胞に処理してERKのリン酸化を5分から60分までいくつかタイムポイントを取って見ています。 だいたい10分ごろがピークになるのですが、ピークでもコントロールとの差が小さく、差が見えたり見えなかったりで、なかなかきれいにできません。 事前に目的GPCRが自研究室にあるLotで発現していることはRT-PCRで確認しています。（よい抗体がないためWBでは確認できていませんが、その細胞株で発現していることはよく知られています） FBSによる影響を除くため薬液処理前日に無血清培地に交換し、当日もう一度その培地で細胞をwashしてから薬液を加えています。 細胞を空気にさらす回数が多いのが問題なのかと考え、薬液を溶かした培地を古い培地と交換していたのを、培地を除かずに濃度が合うように高めの濃度で溶かしたアゴニストをそのまま添加するような変更も試しましたが、特に改善は見られませんでした。 過去に研究室にいたメンバーの中に上手にできる人がいたのですが、すでに去っているので実験を見てもらうこともできず、指導教員にも「できないのは手技が悪いから」のようなことを遠回しに言われ、そこそこ細胞実験の経験もある身としては、原因がわからずとても悔しい思いです。自分自身のためは当然ですが、今後の後輩のためにもなんとか原因を見つけて解決したいと考えています。 こちらのフォーラムの経験豊富な皆さまからアドバイスをいただけると幸いです。

全8件 ( 1 〜 8 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

このトピックにメッセージを投稿する 名前  メール  　アドレス非公開    タイトル  本文       設定  クッキーを保存（次回の入力の手間を省けます） 上に上げない（トピックの一覧で一番上に移動させません） 解決（問題が解決した際にチェックしてください） 暗証  半角英数字8-12文字の暗証番号を入れると、あとで削除、修正ができます。 送信

---

〔使い方〕 「アドレス非公開」をチェックすれば、自分のメールアドレスを公開しないで他の方からメールを受け取れます。 問題が解決した際には、解決ボタンをチェックして解決した旨のコメントをつけてください。これは、初めにトピックを作った人と管理人のみが可能です。 半角カタカナ、機種依存文字(全角ローマ数字、○の中の数字等)は文字化けの原因となりますので使わないでください。

---